用松针制备叶绿素铜钠盐的稳定性测试

于进 沈瑶 刘楚玲 何正力 张袁松

(1. 西南大学医院, 重庆 400716;2. 西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院, 重庆 400716)

从植物中提取的天然叶绿素在医药、食品、化妆品、着色剂等领域具有广泛的应用,但天然叶绿素不溶于水,稳定性差,其应用受到极大限制。天然叶绿素经过置铜反应,将卟啉环中心的配位金属离子置换为铜原子,叶绿素铜酸再经过成盐反应,生成的叶绿素铜钠盐则是一种高稳定性的金属卟啉,具有较高的生物活性,无毒副作用,对肿瘤具有直接或间接的抑制作用[1]。叶绿素铜钠盐是联合国粮农组织、世界卫生组织(FAO/WHO)和我国食品添加剂标准委员会批准使用的天然绿色素[2-4]。在养蚕业的大宗副产物蚕沙中,叶绿素的含量约为0.50%～1.79%,是提取叶绿素的重要原料之一[5]。早在20世纪80年代,华南农业大学黄自然教授研究团队就建立了利用蚕沙提取叶绿素铜钠盐的技术体系,并实现了产业化生产,产品已经在医药、食品、保健品及化妆品中被广泛地应用[6]。

松针中的叶绿素含量较一般绿色植物高,是潜在的叶绿素产品原料来源。我国松树资源分布广泛,仅松针叶的蕴藏量就在1亿t以上,而且松针是一种可再生的天然资源,因此,利用松针为原料制备叶绿素,开发前景看好[7-8]。我们用马尾松的松针为原料提取叶绿素并制备成叶绿素铜钠盐,采用紫外吸收光谱法测试松针叶绿素铜钠盐的稳定性,为其应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 原料及主要试剂和仪器

采集冬季马尾松松针,摊开室内自然晾干,60 ℃以下热风风干至含水率在12%以下,切成3～5 cm的长段,粉碎后过筛(30目),放冰箱内4 ℃保存备用。

主要试剂:丙酮、乙醇、石油醚、NaOH、CuSO4、盐酸,均为分析纯。

主要仪器:HH-4恒温水浴锅(国华实验仪器有限公司),JA2003A电子天平(Acculab),78-1磁力加热搅拌器,Y802N型八篮恒温烘箱(南通宏大实验仪器有限公司),TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析),data color 110TM 分光测色仪(美国德塔)。

1.2 提取工艺基本流程

松针粉→加水润湿软化→浸提→过滤→皂化→石油醚萃取→酸化→铜代→过滤→析出叶绿素铜酸→成盐→干燥。

1.3 叶绿素铜钠盐样品的稳定性测试方法

1.3.1 紫外光谱吸收曲线的测定

将按上述方法提取制得的叶绿素铜钠盐粗品加蒸馏水配成质量分数为0.1%的溶液,以蒸馏水作参比,用双光束紫外可见分光光度计在350～700 nm 波段扫描,测定其吸光度获取吸收曲线[4]。

1.3.2 不同光照条件下的稳定性测试

将质量分数为0.1%的叶绿素铜钠盐溶液分3份(每份50 mL),分别置于直射光下、室内自然光下及黑暗条件下处理,每天用双光束紫外可见分光光度计测定403 nm处的吸光度,连续测试25 d。计算各处理样品的叶绿素铜钠盐保存率:保存率= 末吸光值/ 初吸光值×100%。

1.3.3 不同pH条件下的稳定性测试

取配好的质量分数为0.1%的叶绿素铜钠盐溶液,分成7份(每份30 mL),用NaOH、HCl调节叶绿素铜钠盐溶液的pH值分别为2、4、6、7、8、10、12,在室温下放置60 min,用紫外可见分光光度计测定不同pH的样品溶液在403 nm处的吸光度。

1.3.4 不同温度条件下的稳定性测试

将提取的叶绿素铜钠盐样品配制成质量分数为0.1%、pH 值为7 的溶液,分成6份(每份30 mL),然后放在恒温水浴锅中分别经20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃处理60 min,再冷却至室温,用双光束紫外可见分光光度计测定其在403 nm处的吸光度(以蒸馏水作参比),并与加热前进行比较,计算其保存率。

1.3.5 耐氧化性及耐还原性测试

分别配置质量分数为5%的Na2SO3、H2O2溶液,各取2 mL分别加入已配好的30 mL 质量分数为0.1%的叶绿素铜钠盐溶液中,在60 min内观察溶液颜色的变化,并以蒸馏水作比较,用双光束紫外可见分光光度计测量2份处理样品溶液在403 nm 处随时间变化的吸光度。

2 结果与分析

2.1 叶绿素铜钠盐的紫外吸收光谱

测定用松针制备叶绿素铜钠盐样品的吸光度,得到的吸收曲线如图1所示,其最大吸收波长为403 nm。与詹永乐[5]利用蚕沙制得的叶绿素锌钠盐的吸收曲线比较,曲线最大吸收峰位置一致。

图1 用松针提取叶绿素铜钠盐的紫外吸收光谱

2.2 叶绿素铜钠盐的稳定性

2.2.1 光照对叶绿素铜钠盐稳定性的影响

测定用松针制备的叶绿素铜钠盐在不同光照条件下的稳定性,结果如图2所示。在黑暗条件下放置的叶绿素铜钠盐其吸光度无大的变化,溶液的颜色仍保持透明的亮绿色;在室内自然光和直射光照射条件下,叶绿素铜钠盐的吸光度明显下降,溶液的颜色也变浅呈浅黄绿色。计算3组样品放置25 d后的叶绿素铜钠盐保存率,黑暗组样品为96.5%,室内自然光组样品为91.8%,直射光组样品为72.9%。由此可见,光照对叶绿素铜钠的稳定性有很大的影响,产品在保存时建议避光存放。

图2 不同光照条件下叶绿素铜钠盐的吸光度变化

2.2.2 pH对叶绿素铜钠盐稳定性的影响

测定用松针制备的叶绿素铜钠盐在不同pH条件下的稳定性,结果如图3所示。叶绿素铜钠盐在pH 7～12 的范围内吸光值变化不大,说明在中性和碱性环境中叶绿素铜钠盐较稳定;在pH<6 的酸性条件下,样品的吸光值明显较小,而且随酸性的增强吸光值逐渐减小,当pH=2时,溶液颜色变成浅绿色并出现沉淀现象。分析可能是由于在强酸性条件下,叶绿素铜钠盐变成叶绿素铜酸,由于叶绿素铜酸难溶于水,故使得溶液中出现沉淀现象,溶液的颜色变浅。该结果说明强酸性环境中叶绿素铜钠盐不太稳定,容易分解。

图3 不同pH条件下叶绿素铜钠盐的吸光度变化

2.2.3 温度对叶绿素铜钠盐稳定性的影响

测定用松针制备的叶绿素铜钠盐在不同温度条件下的稳定性,结果如图4所示。在温度<80 ℃时,随着温度的升高,叶绿素铜钠盐溶液的吸光度变化不大,溶液颜色仍为绿色;当温度上升至80～100 ℃之间,其吸光度明显减少。据此建议叶绿素铜钠盐的储存温度最好控制在80 ℃以下。

图4 不同温度条件下叶绿素铜钠盐溶液的吸光度变化

2.2.4 叶绿素铜钠盐的耐氧化性及耐还原性

测定用松针制备叶绿素铜钠盐的耐氧化性和耐还原性,由图5可知:随着放置时间的延长,加入5% H2O2的叶绿素铜钠盐溶液的吸光度下降,颜色变为浅绿色,且放置时间越长其样品溶液的颜色越来越浅,最终接近无色;而加入5% Na2SO3的叶绿素铜钠盐溶液其吸光度基本上没有变化,溶液颜色始终呈亮绿色。测试结果说明:氧化剂在短时间内对叶绿素铜钠盐的影响不大,但长时间会产生很大的影响;而还原剂对叶绿素铜钠盐的影响不大。

图5 加入氧化剂或还原剂后叶绿素铜钠盐的吸光度变化

3 小结

本试验利用来源丰富的松针制备叶绿素铜钠盐,测试样品的紫外光谱吸收曲线有2个吸收峰值,其最大峰值的吸收波长λ=403 nm。对制备的松针叶绿素铜钠盐溶液的稳定性进行测试,结果提示:叶绿素铜钠盐对光照敏感,应注意避光存放;叶绿素铜钠在低于80 ℃的条件下稳定,但温度高于80 ℃时稳定性明显下降,其最佳保存温度应控制在80℃以下;氧化剂短时间内对叶绿素铜钠盐稳定性影响不大,但长时间会造成较大影响,而还原剂对松针叶绿素铜钠盐稳定性影响很小,故在使用时应尽量避免接触氧化剂;叶绿素铜钠盐适合于在pH 6～12范围内的微酸、中性或碱性条件下使用。