VAV家族在膀胱尿路上皮癌中的表达及其与预后的关系

黄 翔,蔡宏佳,张 能

(遵义医科大学附属医院泌尿外科,贵州 遵义 563000)

膀胱癌作为泌尿外科第二常见肿瘤,其高发病率和高病死率严重困扰着临床医生和患者[1],2020年全球膀胱癌新发病例约57万例,死亡约21万例[2]。其最为常见的病理类型为膀胱尿路上皮癌,主要特点为易复发、易进展,患者往往需要行多次手术治疗及膀胱灌注化疗,给患者及家庭带来严重的经济负担。迄今为止,几乎没有特异性和有效的靶向治疗。因此,寻找膀胱癌的潜在生物标志物并确定其潜在机制可能有助于找到新的治疗方法。

VAV家族包括VAV1、VAV2和VAV3,这些蛋白质的主要功能是作为Rho-GTPase家族成员的鸟苷核苷酸交换因子(GEF)[3]。VAV家族是一个特殊亚类,因为它们是信号转导过程中唯一受直接酪氨酸磷酸化正向调节的GEF。它们在细胞和组织上分布有重叠,但并不完全相同,这些蛋白质含有高度相似和复杂的结构,各自包含了多个功能结构域,并参与各种细胞信号传导过程,包括调节细胞骨架组织、细胞转化等[4]。它们在不同的细胞类型中都扮演了关键信号分子[5-7],还能作为促癌因素驱动下游多条通路来促进肿瘤的发生、发展。但是它们在膀胱尿路上皮癌中表达如何尚少见相关研究。为研究膀胱尿路上皮癌组织中VAV家族表达及意义,本实验检测了VAV家族在膀胱尿路上皮癌及正常膀胱尿路上皮组织中的表达,分析了VAV家族表达与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1数据来源 通过TCGA数据库网站(https://portal.gdc.cancer.gov/) 下载膀胱尿路上皮癌的基因数据和临床资料,一共获得408例膀胱原发肿瘤患者和19例正常尿路上皮组织受试者的有效数据。

1.1.2标本来源 选取2020年1月至2021年12月在本院住院行膀胱肿瘤电切术且术后病理检查结果证实为膀胱尿路上皮癌的患者标本60例(包括低级别和高级别膀胱尿路上皮癌各30例),以及30例行膀胱癌根治术后患者的正常膀胱黏膜(镜下未发现癌细胞)。所有入选患者均有完整的临床病理资料。

1.2方法

1.2.1数据处理 使用R语言进行数据提取与分析,主要使用的R语言有dplyr、tidyverse、limma、ggplot2、survival。

1.2.2主要实验试剂 DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司,VAV1、VAV2一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司,VAV3一抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.2.3免疫组织化学 膀胱尿路上皮癌组织石蜡切片脱蜡,PBS冲洗后加入山羊血清封闭液,滴加一抗,4 ℃过夜,PBS冲洗3次;滴加二抗,37 ℃ 30 min,PBS冲洗3次,滴加新鲜DAB显色液,阳性为棕黄色,苏木素复染,将切片依次置于分度无水乙醇和二甲苯中分别浸泡,中性树胶封片。

免疫组织化学染色结果通过半定量计分的方法进行蛋白表达的评价,染色强度评分原则如下:不着色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;阳性染色的百分比评分如下:<5%为0分、5%～25%为1分、>25%～50%为2分、>50%～75%为3分、>75%为4分。最终免疫组织化学染色得分(0～7分)为组织标本的染色强度加上相对应的阳性染色百分比,总分0～1分为阴性,2～3分为弱阳性,4～7分为阳性。

1.3统计学处理 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析,采用秩和检验对VAV1、VAV2、VAV3在不同组织中的表达差异进行统计学处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TCGA数据中VAV家族在膀胱尿路上皮癌和正常膀胱尿路上皮组织中的表达情况 通过R语言软件提取TCGA原始数据并分析后,结果显示,VAV1在膀胱尿路上皮癌组织及正常膀胱尿路上皮组织中表达比较,差异无统计学意义(P>0.05),VAV2、VAV3在膀胱尿路上皮癌组织中表达高于正常膀胱尿路上皮组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 VAV家族在正常膀胱尿路上皮组织和膀胱尿路上皮癌组织中的表达情况

2.2免疫组织化学染色结果 通过免疫组织化学染色正常膀胱尿路上皮组织、低级别和高级别膀胱尿路上皮癌组织各30例,3种类型的组织又分别染色VAV1、VAV2、VAV3各10例,结果显示,VAV1在正常膀胱尿路上皮组织和膀胱尿路上皮癌组织中表达比较,差异无统计学意义(P>0.05),VAV2、VAV3在膀胱尿路上皮癌中表达较在正常膀胱尿路上皮组织中增高,差异有统计学意义(P<0.05),VAV1、VAV2、VAV3在不同级别膀胱癌组织中表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05),说明VAV1、VAV2、VAV3与膀胱的分化程度无明显相关性(P>0.05),见表1、图2。

表1 膀胱尿路上皮癌组织和正常膀胱尿路上皮组织中VAV家族的免疫组织化学染色结果

图2 VAV家族在正常膀胱尿路上皮组织、低级别和高级别膀胱癌组织中的表达情况(免疫组织化学染色,20×)

2.3VAV家族与患者预后的关系 采用R语言进一步分析TCGA数据,提取出VAV1、VAV2、VAV3 mRNA表达量、生存时间及结局,绘制生存曲线图,结果显示,VAV1、VAV2的表达与患者生存时间无明显相关性(P>0.05),VAV3表达越高,患者生存时间越短(P<0.000 1),见图3。

图3 VAV家族不同表达的膀胱癌患者生存曲线

3 讨 论

VAV家族是GEF中的Dbl同源性亚家族中最著名的一类蛋白,GEF是催化Rho蛋白中鸟苷二磷酸(GDP)与三磷酸(GTP)交换的酶,使GTP酶在细胞信号传导过程中从非活性快速转变为活性GTP结合状态。VAV蛋白在蛋白酪氨酸激酶控制的许多生物过程中发挥着关键作用。它们可以作为衔接蛋白,因此也体现了大多数Rho-GEF的调控复杂性。VAV蛋白对中枢神经、心血管和免疫系统的稳态至关重要[3,8]。

在本研究中,使用R语言提取TCGA的原始数据,分析结果发现VAV1在膀胱尿路上皮癌与正常膀胱尿路上皮组织中表达无明显差异,而VAV2和VAV3在膀胱尿路上皮癌中的表达均高于正常膀胱尿路上皮组织。为验证此结果,收集膀胱尿路上皮癌患者病理标本行免疫组织化学验证,其结果与生物信息学数据相符。通过分析VAV2和VAV3与膀胱癌患者预后的关系,发现VAV3的高表达与患者不良预后有明确相关性,因此,VAV3作为膀胱癌重要的调节因子具有进一步探索的意义。

VAV3是Rho-GTP酶核苷酸交换因子VAV家族的第3个成员,参与各种细胞信号传导过程,其通过经典的Dbl结构域激活Rho家族GTP酶,如RhoA、Rac1和Cdc42[9-10]。各种受体酪氨酸激酶(RTK)激活VAV蛋白,导致其底物的Dbl结构域开放[9,11]。VAV3还具有调节细胞运动、增殖和分化的功能。VAV3与癌症的进展和复发相关,并介导对某些癌症治疗的抵抗[12]。

在VAV家族中,VAV3的缺乏会导致骨量密度增加[13]、交感神经过度活跃、心血管功能障碍和伤口愈合受损[13-15]。VAV3在肿瘤的发生和转移中也扮演了重要角色。在前列腺癌中,VAV3通过提高AR-V7的活性导致去势抵抗前列腺癌的发生[16]。在胃癌患者中也发现VAV3表达与肿瘤分化、肿瘤浸润、淋巴结转移、神经血管浸润和临床病理分期显著相关,表明VAV3的表达与癌症的浸润、转移和恶化呈正相关(P<0.05),同时生存分析也显示,高表达VAV3的患者预后更差及生存时间更短[17]。

尽管本研究结果仅显示VAV3与膀胱癌患者的不良预后有明显关系,但是其他研究结果却发现VAV2和VAV3在乳腺癌中共同作用可导致患者在总体生存率、肿瘤复发及转移事件方面产生更加不良的预后。当VAV2或VAV3缺失时,癌症细胞向肺的转移能力受到损害,而当2种VAV蛋白同时缺失时,癌症的转移能力消失。VAV2;VAV3敲低细胞中2种VAV蛋白的异位共表达挽救了原发性肿瘤发生和肺转移;相反,2种单一VAV蛋白中任何一种的再表达均未能恢复VAV2;VAV3敲低细胞的致瘤特性[18]。针对这一结果,考虑可能文献的实验结果是来自动物实验,而作者的分析结果来源是TCGA下载的临床数据,相同的基因在动物和人类中的表达情况或对预后的影响可能会出现差异,或者是因为TCGA的数据量不足而导致差异有统计学意义(P<0.05)。对于VAV2是否单独或联合VAV3产生作用,接下来还将通过科学研究来进一步验证。

本研究结果显示,VAV3的表达可能是预测膀胱尿路上皮癌患者预后的一个有价值的独立危险因素,可能为进一步了解膀胱尿路上皮癌的发病机制带来新思路,也能为治疗提供新靶点。