基于UPLC-MS/MS的土壤中敌草隆残留检测技术

施超宇，孙晓欣，吴嵘，杨勇，王雪，肖学喜

(浙江中一检测研究院股份有限公司，浙江 宁波 315040)

敌草隆(diuron)是取代脲类除草剂中的一类，分子式为C9H10Cl2N2O，其除草作用以光合作用抑制剂的方式实现。在被植物根系吸收后，敌草隆会迅速扩散至茎和叶，从而抑制其光合作用，达到除草效果[1]。低剂量的敌草隆能够根据位置和时间的差异进行选择性除草，而高剂量的敌草隆则能作为灭生性除草剂。由于其高药效、低用量、广谱杀草的特点，敌草隆被广泛用于水稻、棉花、甘蔗等耕作区除草，也可用于非耕作区的杂草[2]。

敌草隆具有不溶于水、熔点高等性质，导致其在施用过程中具有稳定性好、残留性强的特点。当敌草隆作为除草剂被广泛施用到田间后，未被植物根系吸收的部分会扩散到多种环境介质中，包括大气、水体以及土壤环境，且能长期滞留。其中，敌草隆在土壤中的残留问题最为显著，且存在随降雨作用进一步污染地表、地下水的潜在生态风险[3]。

目前，美国、加拿大、法国、荷兰和日本等国家在水中相继检测出敌草隆，其中美国和加拿大已将敌草隆列为环境污染物重点监测对象，同时，美国环保局宣布对敌草隆限量使用[4-10]。相关研究表明，敌草隆及其代谢产物通过水生动物-鸟类-哺乳类等食物网的传递作用产生生物富集，且其对食物网中的多种动物具有毒副作用和一定的致癌性[11]。此外，敌草隆能影响人类的内分泌系统，影响人体的正常代谢，对人体具有致癌、致突变潜在危害[12-13]。

目前，敌草隆的检测主要通过气相色谱法[14-15]、气相色谱-质谱法[16]、液相色谱法[17-20]、超高效液相色谱[21]、液相色谱-质谱法和电流分析法[22]等，而超高效液相色谱-质谱联用法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)用于土壤中敌草隆检测的相关报道较少。超高效液相色谱-质谱联用法能够更加精确地检测敌草隆，减少杂乱峰的干扰。因此，本研究综合采用加压溶剂萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法对土壤中残留的敌草隆开展分析，为土壤中敌草隆残留分析提供一种新思路。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

冷冻干燥机(新芝，SCIENTZ-50ND)；加压流体萃取仪(赛默飞，ASE350)；超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪(岛津，8045)。

敌草隆标准品溶液：称取敌草隆标准品(1 000 mg·L-1，北京坛墨质检科技有限公司)0.10 g，用100 mL甲醇定容作为标准贮备液(1 000 μg·mL-1)，4 ℃避光保存6个月。根据需要，于10 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度，稀释为敌草隆标准使用液(10 μg·mL-1)；甲醇(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；二氯甲烷(色谱纯)；乙酸铵(色谱纯)；乙酸铵-甲酸水溶液(0.01%甲酸水+5 mmol·L-1乙酸铵)；固相萃取柱：填料为Carb/PSA石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱工作条件

色谱柱：C18柱，(柱长100 mm，内径2.1 mm，粒径3.0 μm)；柱温：40 ℃；进样量：10 μL，流速为0.3 mL·min-1；流动相：包括流动相A和流动相B，流动相A：0.01%甲酸+5 mmol·L-1乙酸铵；流动相B：甲醇。

1.2.2 质谱工作条件

电离方式：正离子模式(ESI+)；多反应监测MRM模式；雾化气：3 L·min-1，雾化气为氮气；加热气：10 L·min-1；接口温度：300 ℃；脱溶剂管温度：250 ℃；加热块温度：400 ℃；干燥器流量：10 L·min-1；碰撞气为氩气。

1.2.3 冷冻干燥机工作条件

真空度<10 Pa，冻干时间24 h。

1.2.4 压力溶剂萃取仪工作条件

压力10.34 MPa，萃取温度100 ℃，加热5 min，静态萃取5 min，冲洗量45%，吹扫时间70 s，循环萃取2次。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

去除所采集的土壤样品中含有的沙砾和植物根系等杂质后，使用冷冻干燥机对初步处理的土壤样品进行冷冻干燥，将冷冻干燥后的土壤样品进行研磨，过筛(1 mm孔径)，装入棕色玻璃瓶并密封，待用。

1.3.2 敌草隆萃取

称取20.0 g的待用土壤，装入快速溶剂萃取仪配备的萃取池中，加入甲醇-二氯甲烷(体积比1∶2)混合溶剂(体积)，使用压力溶剂萃取仪的加压流体萃取模式。萃取结束后，收集萃取液。

使用5 mL体积比为1∶9的甲醇-二氯甲烷混合溶剂活化Carb/PSA石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基固相萃取柱，活化结束后，取5 mL甲醇-二氯甲烷混合溶剂洗脱萃取柱，收集洗脱液；利用水浴氮吹仪浓缩淋洗液，氮吹仪氮吹温度35～50 ℃，浓缩至1 mL左右。将浓缩后的淋洗液加至固相萃取柱中进行净化提取，收集萃取液；使用体积比为1∶9的甲醇-二氯甲烷混合溶剂洗脱，再次收集洗脱液，合并两次洗脱液；用水浴氮吹仪对洗脱液进行浓缩，氮吹温度为40 ℃，浓缩至1 mL以下，加入少量甲醇淋洗瓶壁，继续浓缩至近干，用甲醇溶液定容至1 mL，振荡混匀，上机测试。

2 结果与讨论

2.1 提取条件优化

丙酮、甲醇等有机溶剂常用于提取土壤中的敌草隆，在以往研究中，甲醇对不同介质样品中敌草隆的选择性较强，是一种较为理想的提取剂[18]。为了进一步优化土壤中敌草隆的提取条件，本方法比较了甲醇、二氯甲烷、二氯甲烷-丙酮、二氯甲烷-甲醇等不同种类和混合比例的提取液对冻干土壤中敌草隆的提取效率(图1)。

图1 不同提取液对敌草隆提取效率的影响Fig.1 Effect of different extraction solutions on the extraction efficiency of diuron

实验结果表明，使用甲醇提取时，由于提取液中含水量较高，会使得敌草隆检测值偏低，导致检测结果失真；使用二氯甲烷提取时，提取液中容易含有较多杂质，存在基线效应，对目标化合物的检测结果产生干扰；使用二氯甲烷-丙酮提取时，目标化合物回收率较低，仅在70%左右；采用二氯甲烷-甲醇体系进行提取，且二氯甲烷和甲醇比例为2∶1时，敌草隆提取率较高，约为75%，有机相中含水率低且提取物中所含杂质较少。因此，最终选择使用二氯甲烷-甲醇2∶1的混合溶液进行2次加压流体萃取，确保敌草隆能最大程度被提取。

2.2 梯度洗脱程序

本方法采用梯度洗脱，流动相选取0.01%甲酸+5 mmol·L-1乙酸铵和甲醇，流动相梯度洗脱参数如表1所示。在该梯度洗脱程序下得到的敌草隆样品，在保留时间为8.513 min时出峰，出峰时间适当，峰形尖锐，平衡时间短(图2)，可以排除来自其他成分的干扰，目标组分可与样品中其他组分较好地分离，能更精确分析土壤中敌草隆的残留量。

表1 流动相梯度洗脱参数Table 1 Parameters of mobile phase gradient elution

图2 土壤中敌草隆谱图Fig.2 Diuron spectrum in soil

2.3 方法验证

2.3.1 标准曲线与定量限

准确移取100 μL敌草隆标准贮备液(1 000 μg·mL-1)于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成敌草隆标准使用液(10 μg·mL-1)。分别吸取适量的敌草隆标准使用液，用甲醇配制成浓度依次为20、50、100、200、500 μg·L-1的系列标准工作液。使用超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪对标准工作溶液按照浓度由低到高进行检测分析，以敌草隆浓度为X，峰面积为Y建立标准工作曲线，获得敌草隆的标准工作曲线(图3)。该方法下的敌草隆在浓度范围20～500 μg·L-1内呈现较好的线性关系(R2=0.999 5)，标准曲线回归方程为Y=1 526.21X+9 850.80。

图3 敌草隆标准工作曲线Fig.3 Standard working curve of diuron

按照HJ 168-2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》检出限的确定方法，重复7次空白试验测定空白加标样品，检测结果平均值为12.570 μg·g-1，标准偏差为0.91%，计算本方法的检出限为0.000 287 μg·g-1，以4倍检出限计算定量限为0.001 148 μg·g-1，结果见表2。本方法分析计算所得检出限显著低于目前已有的其他土壤中敌草隆检测方法，能够更为精确地检测环境中的敌草隆残留。

表2 敌草隆的检出限和定量限(n=7)Table 2 Limit of detection and limit of quantification of diuron(n=7)

2.3.2 回收率和精密度

在20 g土壤空白样品中添加敌草隆标准溶液，其中敌草隆加标量按照40、200和400 ng分别设置6个平行样，进行前处理与检测。检测结果如表3所示，3个浓度下分别进行6次加标，加标回收率在71.2%～90.3%，3个浓度平均回收率分别为79.2%、84.5%和80.5%；3个浓度的加标回收率的相对标准偏差在1.7%～9.4%，平均为6.06%。该方法的回收率、精密度和准确度符合土壤有机物检测对于回收率(70%～130%)、精密度(<10%)和准确度的相关要求。

3 结论

建立加压溶剂萃取-超高效液相色谱-质谱联用检测土壤中敌草隆残留量的方法，敌草隆在20～500 μg·L-1范围内具有良好的线性关系，且灵敏度、准确度均符合要求，相关系数为0.999 5，且目标峰分离效果较好；敌草隆的加标回收率为71.2%～90.3%，相对标准偏差为1.7%～9.4%，检出限为0.000 287 μg·g-1。该方法有利于对土壤中敌草隆残留量大批量检测的操作，提高了目标物的萃取效率和检测效率，降低了检测难度，提高样品检测准确性。