基于网络药理学和分子对接探讨山药治疗胃癌的作用机制

张靓,唐芳婷,王红,唐萍,王若璇,李跃军

(湖南中医药大学 湖南省直中医医院 肿瘤医学中心, 湖南 株洲,412000)

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,病死率为第三位[1-2]。中国是胃癌的高发区域,全世界超40%的新发胃癌位于中国[3]。目前主要采用外科手术、放疗、化疗、免疫治疗和靶向治疗,但是中晚期胃癌生存率低,总体预后不佳,临床亟需开发新的治疗手段[4]。

胃癌的基本病机是脾胃亏虚,脾胃为后天之本,可运化水谷及水液,胃癌病人脾胃受损,人体气、血、津液均生化不足,全身脏腑、经络、骨骼及肌肉得不到充分濡养而不能发挥正常的生理功能,故中医以健脾益气,恢复正气为主。薯蓣丸源自《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》“虚劳诸不足,风气百疾,薯蓣丸主之”,以山药为君药,多用于治疗慢性虚损性疾病,研究表明薯蓣丸联合化疗可以减轻晚期胃癌患者食少、乏力、腹胀等临床症状,还可减轻化疗所致胃肠道不良反应[5-6]。

胃癌患者临床常用健脾益气的中药,以提高正气及增强人体免疫力[7]。山药是中药中重要的药食同源药材,用以补气养阴、健脾益肺、涩精止带,现代药理学研究表明山药具有抗炎、抗肿瘤、促进胃肠功能、减缓衰老、调节免疫、降血糖血脂等多种生物学活性[8-9]。

但是由于中药存在多靶点、多成分的特点,导致目前对山药的抗胃癌作用机制研究尚不全面。网络药理学基于数据系统实现了”一药多靶”和“多成分-多靶标”的研究模式,为中药研究提供了新视角[10]。本研究基于网络药理学和分子对接两方面探究山药治疗胃癌的核心成分及潜在靶点,并通过分子对接进一步验证二者可有效结合,为后续的实验提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 筛选山药的有效成分及潜在靶点

通过中药系统药理学数据库和分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php),以“山药(Rhizoma Dioscoreae)”为搜索关键词,筛选条件为“口服生物利用度(oral-bioavailability,OB)≥30%”和“类药性(drug-similarity,DL)≥0.18”,获取山药的有效成分及靶点。在UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中限定”Homo sapiens”及”Reviewwed”筛选山药有效成分中被证实和人类密切相关的靶点,并将其转化为基因的Symbol。

1.2 筛选胃癌相关靶点并预测山药作用于胃癌的靶点

在GeneCards(https://www.genecards.org/,筛选条件为relevance score≥1)、OMIM(https://omim.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(https://db.idrblab.net/ttd/)5个数据库中分别以gastric cancer为关键词搜索胃癌的相关基因。在Rx64 4.1.2中利用VENNY2.1安装包(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)去重后取并集得到胃癌发病的相关基因,并整理山药靶基因和胃癌相关基因的交集。

1.3 中药调控网络分析

借助Cytoscape 3.8.0软件绘制山药有效成分-靶点-胃癌调控网络的可视化图。

1.4 PPI网络构建

将药物靶基因和疾病相关基因的交集导入String平台(https://stringdb.org/),选定物种为Homo sapiens,在得到的蛋白质-蛋白质互作网络中设定相互值>0.9,删除游离节点,得到最终的PPI网络。在Cytoscape 3.8.0中利用CytoNCA插件以“度中心性(degree centrality,DC)”“介度中心性(betweenness centrality,BC)”“接近中心性(closenesscentrality,CC)”“特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)”“网络中心性(network centrality,NC)”“局部边连通性(localaverage connectivity,LAC)”为条件筛选核心靶点。

1.5 GO富集分析与KEGG富集分析

在Rx64 4.1.2中安装“BiocManager”及“org.Hs.eg.db”包,将药物靶基因和疾病相关基因交集的symbol转化为id,运用Rx64 4.1.2和bioinformatics平台(https://www.bioconductor.org/),并安装“colorspace”“stringi”“ggplot2”“BiocManager”“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”包,设置Pvalue<0.05和Qvalue<0.05导出调控网络中的基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.6 分子对接

用Chem3D软件在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中将靶标最多有效成分的小分子配体的2D结构转换成3D结构。并在PDB(http://www.rcsb.org)数据库中获得核心靶点所对应的蛋白结构,运用pymol软件去除蛋白质的水分子、原配体。将小分子配体和蛋白质受体运用AutoDock 1.5.7完成分子对接,并得到可视化的对接图。

2 结果

2.1 山药的有效成分及靶标

依据条件,通过TCMSP数据库共获得山药的有效成分16个,山药的靶点851个,其中有效靶点144个。通过Uniprot数据库进行筛选,得到山药潜在靶点119个,对应12个有效成分。

2.2 胃癌相关靶点及山药作用于胃癌的靶点

通过GeneCards、OMIM、DrugBank、PharmGkb、TTD 5个公开数据库筛选去重后一共获得10 890个胃癌基因。用Rx64 4.1.2整理出山药靶点与胃癌相关基因交集,可得到56个交集基因,并且绘制韦恩图(图1)。

2.3 中药调控网络分析

借助Cytoscape 3.8.0完成山药有效成分-靶点-胃癌的中药调控网络的绘制(图2)。发现山药的多个成分和胃癌的多个靶点具有相关性,表明山药对胃癌有多成分、多靶点的治疗作用。其中与药物成分相连的基因越多,该成分在调控网络中的作用越显著。在此调控网络中排名最靠前的是豆甾醇(Stigmasterol)。

●-山药有效成分;■-胃癌基因图2 药物有效成分-靶点-胃癌的调控网络图Fig.2 Regulatory network diagram of active ingredient-target-gastric cancer

2.4 PPI网络构建

用药物靶基因和疾病相关基因的交集,构建PPI网络,该网络包含35个节点,69条边(图3)。将PPI网络导入Cytoscape 3.8.0,查找PPI网络的核心,得出3个核心靶点,分别是TP53、HSP90AA1、AKT1(图4)。

图3 山药治疗胃癌的蛋白质-蛋白质互作网络Fig.3 PPI network diagram of Rhizoma Dioscoreae treatment of gastric cancer

图4 PPI网络核心靶点Fig.4 Core targets of PPI network

2.5 GO功能富集化分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析可以分为生物过程(biological process,BP)、细胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3个部分。将交集基因进行GO分析得到1 417个条目,其中BP 1 269个,与血管的调节密切相关;CC 54个条目,主要包括突触后膜的组成部分(integral component of postsynaptic membrane)、突触前膜的组成部分(integral component of presynaptic membrane)、突触后膜的固有成分(intrinsic component of postsynaptic membrane)等;MF 94个条目,主要涉及G蛋白偶联胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)、核受体活性(nuclear receptor activity)、配体激活的转录因子活性(ligand-activated transcription factor activity)等;绘制GO柱状图分别展示前10条富集结果(图5)。KEGG通路富集分析得到112条通路,KEGG富集分析显示:与山药治疗胃癌密切相关的通路有化学致癌-受体激活(chemical carcinogenesis-receptor activation)、PI3K-AKT信号通路(PI3K-AKT signaling pathway)、酪氨酸代谢(Tyrosine metabolism)等,用柱状图展示前30条通路富集结果(图6)。

图5 GO富集生物进程、细胞成分、分子功能集合图Fig.5 GO function enrichment analysis of biological processes, cell components, and molecular function set

图6 KEGG通路富集柱状图Fig.6 Enrichment histogram of KEGG pathway

2.6 分子对接结果

拓扑分析找到3个山药抗胃癌的核心基因,分别是TP53(Cellular tumor antigen p53)、HSP90AA1(Heat shock protein HSP 90)、AKT1 (RAC-alpha serine/threonine-protein kinase),将基因的靶点蛋白质与该基因所对应的药物成分,进行小分子配体和蛋白质受体的分子对接,结合能小于0,表示配体分子能与受体蛋白质结合,结合能越小结合活性越强,并将有效成分和靶点分子对接结果进行可视化分析。数据表明,豆甾醇和TP53的最佳结合能为-8.3 kJ/mol;豆甾醇和HSP90AA1的最佳结合能为-7.3 kJ/mol;豆甾醇和AKT1的最佳结合能为-8.8 kJ/mol(表1)。分子对接结果表明核心靶点均与豆甾醇有较强的结合活性,其中对接结果最佳的是AKT1(图7)。

表1 分子结合能量表Table 1 Molecular binding energy scale

图7 AKT1与豆甾醇分子对接Fig.7 AKT1 docking with stigmasterol

3 讨论

中医认为胃癌病位在胃,与五脏密切相关。脾胃为后天之本,胃癌患者多营养不佳,正气亏虚,故以“扶正”为基本原则,以培补脾肾、益气填精养血为基本治法,其所用中药以补虚类为首,归经多属脾、肺、肾、胃经,可选用健脾、补肺、固肾、益精之山药[11]。研究基于网络药理学对山药-有效成分-靶点-胃癌的中药调控网络进行了可视化分析,得到了相关生物学过程及信号通路,并在分子层面完成了对接,展现山药治疗胃癌的本质规律,为后续的基础研究提供依据。

通过分析得到12个山药的有效成分,其中与治疗胃癌关系最为密切的是豆甾醇。豆甾醇属植物甾醇,多见于蔬菜、水果和浆果等植物中,具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗增殖、降胆固醇等作用[12]。在治疗糖尿病、恶性肿瘤、心血管疾病、动脉粥样硬化和皮肤问题方面已得到广泛研究[13]。药物有效成分-靶点-胃癌的调控网络图显示了山药通过多成分、多靶点治疗胃癌的作用机制。

PPI网络表明,山药治疗胃癌的核心靶标包括TP53、HSP90AA1、AKT1。p53为肿瘤抑制因子,主要参与细胞周期阻滞、衰老、DNA修复和细胞凋亡等生物学过程,这与此研究GO富集分析结果相符。研究表明在早期胃腺癌组织中,突变p53蛋白的表达率明显高于正常胃黏膜,且与肿瘤的位置、侵袭深度和分化程度密切相关,可用于胃癌的诊断和筛查[14]。HSP90AA1属于热休克蛋白家族,是一种应激反应分子,主要参与维持蛋白质稳态,其在多种癌症类型中存在过表达,可促进肿瘤转化,确保癌细胞增殖、存活率和侵袭性,并预测癌症患者预后[15]。HSP90AA1可通过PI3K/AKT/mTOR途径促进自噬[16],KEGG富集分析显示PI3K-AKT信号通路与山药治疗胃癌密切相关。AKT1是AKT的亚型之一,参与细胞生长、代谢、增殖、凋亡和其他过程的调节,且AKT是PI3K/AKT通路中的重要蛋白质,还能调节细胞周期蛋白p53的表达[17]。研究表明胃癌中AKT1过表达的患者预后较差,是胃癌预后不良的标志物[18]。PPI网络显示了山药可通过多靶点作用于胃癌。

GO富集分析筛选得到1 417个条目,从分子功能、生物过程和细胞成分3个方面对山药治疗胃癌进行了综合分析,其中生物过程与血管调节密切相关。MICHELINI等[19]研究了一种合成的豆甾醇衍生物((22S,23S)-22,23-dihydroxystigmast-4-en-3-one) 在体外和体内均可以抑制血管生成,并且可以抑制小鼠皮肤中肿瘤细胞诱导的新生血管反应。在胃癌发生发展过程中,肿瘤细胞会促进血管生成,而血管生成又是支持肿瘤生长和发育的关键因素之一[20],所以在胃癌中血管生成等生物过程活跃,这与GO富集分析结果相符。

KEGG通路富集分析共筛选出112条通路,富集分析显示山药在化学致癌-受体激活、PI3K-AKT信号通路、酪氨酸代谢等信号通路上富集显著,表明其有效成分最有可能作用于这些通路发挥抗胃癌的作用。研究表明化学物质可以选择靶向基因的特定区域(如TP53或APC),从而与多种恶性肿瘤之间直接联系[21]。目前临床上络氨酸激酶抑制剂(tyrosine Kinase inhibitor,TKI)正被广泛应用,其作用主要是抑制酪氨酸激酶蛋白级联反应的磷酸化或去磷酸化,对胃癌中TKI敏感人群的有效性适中,但其临床疗效还需进一步验证[22]。PI3K轴被证明在三分之一的恶性肿瘤中被激活,胃癌是受其影响的主要恶性肿瘤之一[23]。磷酸酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-Kinases,PI3K)是脂质激酶家族的成员,可以被多种生长因子和信号转导复合物激活,如G蛋白偶联受体、血管内皮生长因子、受体酪氨酸激酶等[24]。PI3K/AKT通路与细胞生长、发育、细胞凋亡、恶性转化、耐药性相关[25]。

豆甾醇可以通过阻断胃癌细胞中的AKT/mTOR信号通路来诱导胃癌细胞凋亡和自噬。PI3K/AKT/mTOR通路在各种癌症中被激活以促进癌症发展,AKT作为PI3K的下游效应子,可能是PI3K/AKT/mTOR通路中的关键靶点,但目前AKT抑制剂仍在探索阶段[26-27]。基于本研究分子对接结果,豆甾醇与AKT1对接活性较强,KEGG通路富集分析表明PI3K-AKT信号通路在山药治疗胃癌中起关键作用,可为后续研究山药对胃癌的治疗提供新的思路。

综上所述,通过网络数据库筛选出山药12个有效成分及119个潜在靶点,胃癌基因10 890个,山药和胃癌交集基因56个,其中豆甾醇为山药主要活性成分。对PPI网络进行拓扑分析预测关键靶点为TP53、HSP90AA1、AKT1。分子对接发现豆甾醇与山药中的核心靶点均能有效结合发挥抗胃癌作用,与AKT1结合活性最强,其中生物过程与血管调节密切相关,并可能通过化学致癌-受体激活、PI3K-AKT信号通路、酪氨酸代谢等多条通路发挥治疗胃癌的作用。现有数据证明山药对胃癌有治疗作用,为后续基础研究提供了新的思路。