30个灵芝菌株的抗炎活性筛选评价

李 芳, 李浩楠,余梦瑶,贺黎铭,蔡 凌,罗 霞

(四川省中医药科学院菌类药材研究所/菌类药材系统研究与开发实验室,成都 610041)

中药材灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。全年采收,除去杂质,剪除附有朽木、泥沙或培养基质的下端菌柄,阴干或在40～50℃烘干[1]。灵芝是一种应用历史悠久的传统中药,在我国的记载已超过2000年,被历代医药学家认为是滋补强壮、扶正固本的“仙草”,具有补气安神、止咳平喘的功效,能安心神、健脾胃、益气血,临床上多用于治疗失眠、神疲乏力、心悸、肿瘤等。现代研究表明,灵芝含有多种化学成分,其中的活性成分以多糖、三萜、核苷、甾醇类为主,具有一定的抗肿瘤、降糖、保肝、抗衰老等活性[2]。

炎症反应是许多炎症性疾病的早期症状之一,表现为发热、疼痛、发红、和肿胀,常见的炎症性疾病包括皮炎、痛风、关节炎等[3],慢性炎症可以长时间持续存在,从而引起多种疾病,甚至导致肿瘤的产生。目前,非甾体抗炎药是治疗炎症性疾病公认的药物,这些药物通过抑制环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)阻止花生四烯酸代谢为前列腺素E2(PGE2),从而发挥其治疗作用,但长期使用非甾体抗炎药会引起胃肠道反应等毒副作用[4]。因此,寻找安全性高的消炎新药仍然是炎症疾病的重要研究方向。灵芝药用历史悠久、来源广泛、毒副作用少,是天然药物的重要来源之一。近年来,国内外出现了一些关于灵芝抗炎的研究报道,但是研究较少、不够深入。基于此,本研究拟从灵芝核心种质资源库的30个灵芝菌株中提取有效成分,并通过体外实验进行抗炎作用评价,筛选获得具有良好抗炎效果的灵芝菌株,以期为炎症药物开发提供更多的活性原料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物 30个灵芝(Ganodermalucidum)菌株资源保藏于四川省中医药科学院菌类药材研究所,子实体按常规的灵芝袋料栽培方法获得。

1.1.2 实验细胞 RAW264.7 细胞系购自中国科学院细胞库(中国上海),由四川省中医药科学院菌类药材研究所传代保存。

1.1.3 试剂 谷氨酰胺(批号G8540-256)、丙酮酸钠(批号L101019)购自四川爱得科技有限公司;脂多糖(LPS,货号L2880)购自美国SIGMA公司;PRMI-1640培养基(货号:R8755-1L)购自美国SIGMA公司;青霉素-链霉素(批号:V900929-100ML)购自上海百研生物科技有限公司;胎牛血清(货号:C04001-500ML)购自Bovogen 公司;MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝)(批号298-93-1) 购自BIOFROXX公司;萘乙二胺盐酸盐(货号 DC07BA1002)、无水对氨基苯磺酸(货号 DC5BA0731)购自生工生物工程(上海)股份有限公司;亚硝酸钠(NaNO2)、乙醇、NaCl购自成都长联化工试剂有限公司。

1.1.4 仪器 BB5060UV二氧化碳培养箱(Heraeus公司);TS100荧光倒置显微镜(Nikon 公司);Fresco型离心机(SURVALL公司);SW-CJ-1D型洁净工作台(江苏洁净化设备厂);Multiskan Ascen酶标仪(Thermo公司);LD210-1型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);5810R型高速冷冻离心机(德国 EPPENDORF);DK-8D型电热恒温水槽(上海精密实验设备有限公司);25cm细胞刮刀(广州洁特生物过滤股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 灵芝活性成分的提取 灵芝总多糖采用热水回流提取,料液比为1∶50(灵芝/g:水/mL),提取温度为100℃,提取时间为1h,提取2次。所得提取液用定性滤纸过滤2次,再用0.45um微孔滤膜过滤1次,并在旋转蒸发仪上浓缩到70mL左右,在100℃水浴上蒸干,得灵芝总多糖提取物,放于4℃冰箱备用。灵芝总三萜采用乙醇热回流提取法,料液比为1∶50(灵芝/g∶95%乙醇/mL),保持微沸,提取时间为1h,提取2次。所得提取液用定性滤纸过滤2次,并在旋转蒸发仪上浓缩到70mL左右,在100℃水浴上蒸干,得灵芝总三萜提取物,放于4℃冰箱备用。

1.2.2 细胞培养与传代 从液氮罐中取出RAW264.7细胞,复苏后于含10%胎牛血清、1‰抗生素的PRMI-1640培养基中,置37℃、5% CO2培养箱培养。当细胞生长至培养瓶80%左右时,用细胞刮刀将细胞刮下,于培养液中吹打混匀,按1∶4-6传代。

1.2.3 RAW264.7 细胞炎症细胞模型构建及灵芝提取物抗炎活性评价 用不同浓度的LPS(0,2.5,5,10,20,25μg/mL)诱导RAW264.7细胞生成NO构建细胞炎症模型,同时考察LPS对RAW264.7细胞的毒性,综合确定LPS的使用浓度。采用Griess法测定RAW264.7 细胞一氧化氮生成量。Griess A液(0.1%萘乙二胺二盐酸)和 Griess B液(20%溶解在磷酸中的磺胺)等体积混合制备Griess 试剂。以0至100μM 的 NaNO2溶液为标准品,建立标准曲线。培养结束后,从孔板中取100μl上清液,再加100μl Griess试剂,室温孵育30min。用酶标仪测定孔板在540nm处的光吸收值(OD值)。将RAW264.7细胞以每孔4×104个细胞的密度接种到96孔板中,孵育过夜。次日加入含不同灵芝提取物 (终浓度0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)的培养液预先培养2h,再加入 LPS培养48h以诱导NO生成构建炎症细胞模型。计算NO抑制率=(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值×100%。NO含量和炎症反应成正相关,以NO抑制率评价灵芝提取物抗炎活性。

1.2.4 灵芝提取物对RAW264.7 细胞毒性的影响 采用MTT法检测细胞活力以评价灵芝提取物对RAW264.7细胞的毒性影响。将细胞以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔板中,培养过夜,次日加入含不同灵芝提取物 (终浓度0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)的培养液持续培养48h。充分作用后,小心吸出孔板中的培养基,每孔加入100μl PBS和 10μl MTT溶液,培养4h后,每孔加入100 μl SDS溶液,孵育过夜。用酶标仪测试孔板在570nm处的光吸收值(OD值)。计算细胞存活率=给药组平均OD值/对照组平均OD值×100%。

2 结果与分析

2.1 灵芝提取物产率

将30份灵芝种质资源的30个灵芝子实体样品,按照前述方法分别采用醇提和水提方式,获得60个实验样品,提取率见表1。

表1 灵芝提取物产率统计

2.2 炎症细胞模型构建

结果表明,不同浓度的LPS(0,2.5,5,10,20,25μg/mL)诱导RAW264.7细胞后,NO生成量均明显增加,成功诱导形成细胞炎症,见图1。MTT实验结果表明,2.5和5μg/mL LPS对RAW264.7细胞活力无明显影响,其余高浓度LPS均对RAW264.7细胞活力有显著抑制作用,见图2。综合考虑,本研究确定以2.5 μg/mL LPS作为建立炎症细胞模型的有效浓度。

图1 不同浓度LPS对NO释放量的影响

图2 不同浓度LPS对细胞活性的影响

2.3 灵芝提取物对NO生成的影响

2.3.1 总三萜对NO生成的影响 试验结果表明,30个灵芝总三萜提取物对LPS诱导的Raw264.7炎症模型NO生成有不同程度的抑制作用,除去编号GL154、GL215、GL221、GL222、GL226外,其余25个灵芝总三萜提取物均具有较好的抑制NO生成的作用,抑制率>60%。

2.3.2 总多糖对NO生成的影响 试验结果表明,28个灵芝总多糖提取物对LPS诱导的Raw264.7炎症模型NO生成有不同程度的促进作用,仅编号GL220、GL167具有一定的抑制NO生成作用,抑制率<30%。因此30个灵芝总多糖提取物均不具有抗炎作用。

2.4 灵芝提取物对Raw264.7细胞活力的影响

2.4.1 灵芝总三萜对Raw264.7细胞活力的影响 试验结果表明,30个灵芝总三萜提取物对Raw264.7细胞活力有不同程度的抑制作用,其中编号GL230、GL232、GL234、GL235、GL236、GL237、GL225、GL184灵芝总三萜提取物抑制作用明显,抑制率>40%。

2.4.2 灵芝总多糖对Raw264.7细胞活力的影响 试验结果表明,30个灵芝总多糖提取物对Raw264.7细胞活力有不同程度的抑制或促进作用,其中编号GL227、GL229、GL232、GL234、GL235灵芝总多糖提取物促进增殖作用明显,促进率>40%。

3 讨论与结论

灵芝是我国常用的传统名贵中药材,已有3000多年的药用历史,具有扶助正气、滋补强壮的功效。灵芝资源在我国分布范围很广,北到黑龙江,西到新疆,南到云南,广东等地均有灵芝的存在,其中江西、福建、广东是我国灵芝资源的主产区,我省也有丰富的野生资源[5-8]。现代药理研究表明,灵芝具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化等药理作用。近年来,有研究发现灵芝还具有一定的抗炎作用[9-10]。本研究开展不同灵芝菌株的抗炎活性筛选,以期筛选获得具有较好抗炎活性的灵芝菌株,拓宽灵芝应用方向,提高对灵芝资源的利用度。三萜和多糖是灵芝的主要活性成分,本研究首先通过乙醇提取和水提取的方法分别获得了灵芝总三萜和总多糖,结果表明不同灵芝菌株子实体中的总三萜和总多糖提取得率不同,活性成分含量各有差异。LPS刺激小鼠RAWA264.7细胞炎症模型是体外研究炎症常用的细胞模型[11],NO是炎症反应中释放的常见炎症因子,可作为评价抗炎活性的实验依据[12],适用于类似本研究的大量样品抗炎活性筛选,采用此法能快速获得筛选结果。同时样品对RAWA264.7细胞的毒性作用也是重点考察指标[13]。综合分析,30个灵芝总多糖提取物都不具有抗炎活性;编号GL219、GL 167灵芝菌株的总三萜提取物在浓度为12.5 μg/mL下,兼具抗炎活性良好(NO抑制率>60%)、无细胞毒性的优点,可作为进一步筛选的抗炎原料。