高效聚合抗赤霉病基因育种技术体系的研制

李式昭,邓清燕,涂 洋,伍 玲

(四川省农业科学院作物研究所/农业农村部西南地区小麦生物学与遗传育种重点实验室/粮油作物绿色种质创新与遗传改良四川省重点实验室/农业农村部天府种业创新重点实验室(部省共建),成都 610066)

由禾谷镰刀菌复合种(Fusariumgraminearumcomplex)引起的小麦赤霉病(Fusariumheadblight, FHB)是一种世界性真菌病害,在我国广泛分布于温暖潮湿或半潮湿麦区[1]。21世纪以来,随着全球性气候变暖,耕作制度的改变如麦稻、麦玉轮作和秸秆还田等因素的影响[2],赤霉病呈蔓延扩展趋势,频繁流行,不仅造成小麦大面积减产,还大幅度降低籽粒品质,严重威胁我国小麦生产安全[3]。与此同时,致病菌还产生雪腐镰孢菌烯醇(Nivalenol,NIV)、脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)等毒素污染小麦籽粒,进一步威胁人、畜健康[4]。因此,挖掘抗病基因,解析抗病作用机理,改良品种赤霉病抗性就成为了防治小麦赤霉病危害的有效途径[5]。

小麦对赤霉病的抗性有五种类型,包括抗初始侵入(Type Ⅰ)、抗单穗病症扩展(Type Ⅱ)、抗毒素积累(Type Ⅲ)、籽粒对赤霉病的抗性(Type Ⅳ)和耐病性(Type Ⅴ)[6],属数量性状,受多基因控制。目前已定位的小麦赤霉病抗病QTL数量高达数百个,广泛分布于小麦的21条染色体上[7-8],正式命名的主效抗病基因有7个,其中Fhb4和Fhb5属抗侵染类型,Fhb1、Fhb2、Fhb3、Fhb6和Fhb7则属抗扩展类型。Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5源自普通小麦苏麦3号及望水白,Fhb3、Fhb6和Fhb7则源自小麦近缘属种中的大赖草、披碱草及长穗偃麦草[9-15]。7个主效抗赤霉病基因中,Fhb1是抗性最强且最稳定的抗病基因,对我国抗赤霉病育种有着重要意义[16]。

我国长江中下游麦区、东北春麦区和南部沿海省份等雨量充沛地区一直是赤霉病常发和重发区域。近年来,西南麦区受耕作制度改变及小麦花期暖湿阴雨气候等影响,赤霉病也开始呈现逐年加重的趋势。由于西南麦区属赤霉病偶发病区,有针对性的抗赤霉病育种研究还较少,不仅缺乏抗赤霉病育种资源材料,本地育成品种的赤霉病抗性也普遍较差[17]。因此,建立高效聚合抗赤霉病基因的育种技术体系,快速选育适合当地环境的抗赤霉病小麦新品种就成为当前西南麦区的迫切需求。本文使用改良农艺性状后的抗赤霉病种质与西南麦区主栽品种杂交或复交,在低世代分离群体进行抗赤霉病性弥雾接种鉴定,高世代群体采用单花滴注法接种鉴定,并利用抗赤霉病基因标记进行分子标记辅助育种,以提高西南麦区小麦抗赤霉病育种效率。该技术体系规范了育种过程中赤霉病抗性鉴定及分子标记检测的世代和方法,有效降低了育种成本,结合夏繁加代技术,有望准确、高效选育出适应西南麦区地理环境且聚合已知抗赤霉病基因的小麦新品种。

1 育种目标

通过高效聚合有效的赤霉病抗性基因,实现赤霉病抗性和本地品种(系)丰产性的结合,育成综合性状优良的抗赤霉病小麦新品种。对低世代群体,要侧重于抗性和个体丰产性的选择;对高世代群体,要侧重于抗性、产量性状和群体协调性的结合,并利用抗赤霉病基因标记进行分子标记筛选。

2 育种技术体系流程

2.1 亲本选择

西南麦区缺乏抗赤霉病育种资源材料,而目前已有的抗病品种如苏麦3号、望水白、Frontana等,往往伴随不抗条锈病、产量低、穗密度稀、植株偏高等不良农艺性状,难以在育种中直接应用。因此,要使用农艺性状改良后的抗赤霉病种质与西南麦区丰产品种(系)杂交或复交,才能有效提高小麦抗赤霉病育种效率。现阶段,南京农业大学已培育出抗赤霉病改良新品系如NMAS07(Fhb1+Fhb4+Fhb5)、NMAS22(Fhb1+Fhb2+Fhb4+Fhb5)等,长江中下游麦区也新审定一批抗赤霉病品种如生选6号、宁麦20、扬麦33等,这类品种(系)赤霉病抗性好且稳定,农艺性状相对优良,可作为抗赤霉病育种亲本加以利用。

2.2 低世代群体田间选择及抗赤性弥雾鉴定

对低世代(如单交为F2～F4代,复交为BC1F2～BC1F4代)分离群体,应尽量种植为小区,行长3～6m,行距26.7cm,每小区3～6行,以方便喷雾及后期盖膜保湿。赤霉病接种:采用小区弥雾接种法进行鉴定。在鉴定小区大约10%麦穗扬花(扬花初期)时,利用大型机械喷雾设施或喷壶,向小区内小麦穗部均匀喷洒赤霉病菌分生孢子悬浮液,对育种材料进行大规模抗赤性弥雾接种鉴定。注意开始接种前,应将培养好的分生孢子悬浮液浓度调整至1×104个孢子/mL,并加入1/1000比例的Tween-20。喷雾效果以全区麦穗基本形成雾珠为宜,在弥雾接种后若天气干燥应对鉴定小区进行盖膜保湿处理,以确保分生孢子充分萌发并发病,避免接种失败。

弥雾接种于鉴定小区处于乳熟中后期进行抗性调查,抗性评价标准参考《小麦品种抗赤霉病性田间鉴定技术规程》(DB51/T 1680-2013),根据发病麦穗的平均病害严重度和小区发病普遍率综合进行抗性评价。0级为无发病小穗;1级为零星小穗发病,发病小穗占全穗的5%以下;2级为发病小穗占全穗的5%～24%;3级为发病小穗占全穗的25%～50%;4级为发病小穗占全穗的50%以上;为节约鉴定时间,小区发病普遍率可目测估计。评价标准:平均严重度0级表示免疫(I);1级表示高抗(HR);2级或3～4级且发病普遍率≤20%表示中抗(MR);3级且发病普遍率>20%表示中感(MS);4级且发病普遍率>20%表示高感(HS)。

在低世代群体,田间综合选择农艺性状好,同时抗条锈病和赤霉病的单穗混收混播。至F4代或BC1F4代选种后,得到的F5代或BC1F5代种子单穗单收,进入高世代群体筛选。

2.3 分子标记辅助选择

对F5代或BC1F5代单穗种子,每穗取4粒采用SDS法[18]提取基因组DNA。采用与赤霉病抗性基因Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5[19]紧密相关的8个分子标记(表1)对单穗材料进行检测,均以聚合赤霉病抗性基因的川麦64近等基因系(CM64Fhb1+2+4+5)为阳性对照。

表1 小麦赤霉病抗性基因相应分子标记信息

PCR扩增反应体系为15μL,包含20ng DNA模板,上下游引物各0.5μmol/L,TaqPCR Mix预混液(2 ×,含蓝染料)。PCR扩增程序:94℃预变性3min;94℃变性 30s,52～61℃退火30s,72℃延伸40s,共36个循环;72℃延伸5min,最后4℃保存(程序中退火温度因引物不同而异)。PCR扩增产物通过1.5%(w/v)琼脂糖或8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。

含有抗赤霉病基因的单穗应优先保留,特别是含有多个抗赤霉病基因的单穗更应重点关注,入选单穗按穗行进入下一代田间种植。若时间紧迫,也可优先对抗赤霉病Fhb1基因[16]进行检测。

2.4 高世代群体田间选择及抗赤性单花鉴定

对高世代(如单交为F5～F6代,复交为BC1F5～BC1F6代)群体,将经分子标记辅助选择后入选的单穗种子种植为穗行,行长1.8m,行距26.7cm。赤霉病接种:采用小麦穗部单花滴注接种法进行鉴定。在待鉴定小麦穗行大约10%麦穗扬花(扬花初期)时,选择不同单株的主茎穗,剪去部分麦芒以区别其余麦穗,随后用微量移液器将10μL稀释好的赤霉病菌分生孢子悬浮液(浓度1×106个孢子/mL)注射至麦穗中上部的一个小花内(为方便接种,可将待注射小穗剪去1/3)。每个穗行接种10～15个穗子,接种后用透明塑料薄膜将整个麦穗套住保湿,并注意及时挂牌记载接种日期,保湿72h后去掉塑料袋,之后根据空气湿度情况定期进行喷雾保湿,以保证充分发病。

单花滴注鉴定于各材料接种后25～30d(根据气候每年时间有所差别)进行抗性调查,抗性评价标准参考《小麦抗赤霉病评价技术规范》(NY/T 1443.4-2007)和《小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》(NY/T 2954-2016),根据接种麦穗的平均病害严重度进行抗性评价。0级为接种小穗无可见发病病状;1级为仅接种小穗发病或相邻的个别小穗发病,病斑不扩展到穗轴;2级为穗轴发病,发病小穗占全穗的1/4以下;3级为穗轴发病,发病小穗占全穗的1/4～1/2;4级为穗轴发病,发病小穗占全穗的1/2以上。以接种的10～15个麦穗赤霉病严重度的平均值作为平均病害严重度,评价标准:=0表示免疫(I);0<<2.0表示抗病(R);2.0≤<3.0表示中抗(MR);3.0≤<3.5表示中感(MS);≥3.5表示高感(HS)。

在高世代群体,田间综合选择农艺性状好且基本稳定,群体协调性好,株高适中,穗层整齐,褪色落黄好,且同时抗条锈病和赤霉病的穗子单穗单收,继续播种为穗行。至F6代或BC1F6代穗行选择后,得到的F7代或BC1F7代种子混收进入品系鉴定试验。

2.5 品系鉴定

对已稳定的高世代(如单交为F7代,复交为BC1F7代)群体,种植为小区,小区面积6.67m2,参照《农作物品种(小麦)区域试验技术规程》(NY/T 1301-2007)对入选品系进行农艺性状和抗性调查,重点考察产量三因素和条锈病、赤霉病抗性,择优升入多点品比试验直至推荐参加正式区域试验。

需要注意的是,以上世代选择和鉴定操作应根据具体育种情况为准,若材料稳定很快可提前进入高世代选择,若持续分离则应增加低世代选择的代数和时间。

3 育种实例

3.1 抗赤霉病新材料川1147选育流程

川1147系谱为:17139/NMAS07,其中母本17139(系谱(CM107//CM107/Yr15)F4/川农16)系课题组自育品系,表现丰产性好,高抗条锈病;父本NMAS07引自南京农业大学,含有Fhb1、Fhb4、Fhb5 3个抗赤霉病基因。

按上述高效聚合抗赤霉病基因育种技术体系流程,以17139为母本,NMAS07为父本配置杂交组合,马尔康夏繁F1代,于F2～F4代连续3代进行大规模抗赤性弥雾鉴定,获得的F5代种子(每穗4粒)经提取DNA后进行分子标记筛选,选择含有抗赤霉病基因Fhb1的单穗继续种植为穗行,于F5～F6代连续2代进行抗赤性单花滴注鉴定,获得的F7代种子混收进入品系鉴定试验,表现农艺性状好,遗传稳定,性状整齐一致,兼抗条锈病和赤霉病,命名为川1147。

3.2 抗赤霉病新材料川782选育流程

川782系谱为:17140/生选6号//川16316,首先利用17140与生选6号进行杂交,其中17140(系谱(CM107//CM107/Yr15)F4/川农16)系课题组自育品系,表现丰产性好,抗条锈病;生选6号引自江苏省农业科学院农业生物技术研究所,经国审抗赤霉病。由于F1代组合优势明显但穗子偏小,将F1再次与大穗大粒种质川16316(系谱98-1231//贵农21/生核3295)配置复交组合,马尔康夏繁BC1F1代。

同样按上述流程,BC1F2～BC1F4代连续3代进行大规模抗赤性弥雾鉴定,经分子标记筛选后BC1F5～BC1F6代连续2代进行抗赤性单花滴注鉴定,获得的BC1F7代种子混收进入品系鉴定试验,表现农艺性状好,遗传稳定,性状整齐一致,兼抗条锈病和赤霉病,命名为“川782”。

4 结语

由于机械化易操作,目前西南麦区小麦生产的经营主体已逐步转变为农业种植大户,小麦生产出现播期延长、花期集中、品种多样性下降的特点。而随着全球气候变暖和耕作制度的改变,西南麦区赤霉病流行风险呈逐年增加趋势,若发生赤霉病爆发

图1 抗赤霉病小麦新品系川1147和川782选育流程

流行,将比以往造成更加严重的产量损失和经济损失,因此,培育并推广抗病新品种已成为西南麦区防治小麦赤霉病的关键。本文建立了高效聚合抗赤霉病基因的育种技术体系,在低世代分离群体进行抗赤霉病性弥雾接种鉴定,高世代群体采用单花滴注法接种鉴定,并利用抗赤霉病基因标记进行分子标记辅助育种。该技术体系发挥了从低代起即可有效对农艺性状和抗病性同时展开筛选的优势,且结合分子标记筛选可以大大降低育种成本,并能有效防止选择过程中抗病基因的丢失,提高抗赤霉病育种效率,有望准确、高效选育出适应西南麦区地理环境且聚合已知抗赤霉病基因的小麦新品种。