不同更新方式下亚热带森林土壤病毒群落结构与功能特征

林秋沙，严雨亭，袁程昱，李帅军，贺纪正，于丹婷

(1.福建师范大学地理科学学院，福建 福州 350117；2.福建师范大学湿润亚热带山地生态国家重点实验室培育基地，福建 福州 350117)

异常的自然灾害和过度的人为干扰已经造成了森林大面积退化、生态系统服务功能丧失等严重问题[1]。全球各国正在扩大森林恢复规模，以提供关键的生态系统服务功能和提高生物多样性效益，如碳储存、土壤侵蚀控制、供水和木材生产等[2]。了解森林受到干扰之后的恢复过程是森林生态系统可持续发展的重要需求。自然恢复与人工造林是全球森林恢复的两种主要模式[1]，有研究指出，人工纯林可能会导致土壤衰退、生态系统稳定性下降等问题[3]，而自然恢复往往被认为具有更高的生态系统服务功能[4]。通过对不同更新方式下森林土壤微生物相关指标进行测定比较，能够及时有效地监测土壤微生物群落及功能变化，这对揭示森林管理方式下土壤质量演变的微生物学机理具有重要意义。特别是天然林转换为人工林使得微生物生物量[5]、真细菌比[6]等都显著降低，且土壤微生物群落由K-策略占主导转变为R-策略的微生物占主导[7]，这使得微生物群落结构趋于不稳定。目前相关研究多集中于真菌和细菌，却很少关注到土壤病毒。

土壤微生物能够改善表层土的物理化学性质，保持土壤有机质含量，在森林生态系统的碳氮循环中发挥关键作用[8]。病毒作为地球上最丰富的生物实体[9]，通过调节微生物群落动态[10]、在感染期间重新编程宿主代谢[11]以及作为水平基因转移的载体[12]，在影响土壤微生物群落和功能方面发挥着至关重要的作用。陆地生态系统中76% ～ 98%的有机碳存储于森林生态系统，森林是调节全球碳循环的巨大“生物泵”[13]。研究发现土壤病毒可以作为重要因子调节土壤中的碳损失[14]，而森林土壤病毒丰度高达109VLP·g-1干土[15]，且土壤病毒能够通过感染土壤微生物群对森林生态系统碳动力学产生重大影响[16]。例如，在红树林土壤病毒中鉴定出的参与复杂多糖生物分解的辅助碳水化合物活性酶，就证明了土壤病毒可能通过复杂多糖的生物分解直接操纵碳循环[17]。

为比较不同更新方式下次生林土壤病毒群落及其潜在功能差异，本文选择了白砂国有林场皆伐后自然恢复和人工种植杉木两种更新方式的林地(林龄为40年)为研究对象，以及林龄大于100年的次生林作为对照，利用宏病毒组学，探讨不同更新方式对亚热带森林土壤病毒群落组成与功能的影响，以期为森林经营管理和森林恢复提供关键基础数据。

1 材料与方法

1.1 研究区域与样品采集

采样点位于福建省龙岩市上杭县白砂国有林场(24°46′-25°28′ N，116°16′-116°57′ E)，属中亚热带季风气候，年平均气温为20.1 ℃，年降水量1 600 mm，森林总蓄积76×104m3。本研究于2018年6月采集该林场杉木人工林和天然更新次生林长期试验点土壤。杉木人工林属人工种植林，林龄约40年，天然更新林和原生林均为杉木砍伐后的自然演替林，前者林龄约40年，后者林龄大于100年。其中，杉木人工林乔木层树种以杉木(Cunninghamialanceolata)为优势树种，胸高断面积约为43.37 m2·hm-1；林下植被以闽楠(Phoebebournei)、黄绒润楠(Machilusgrijsii)、粗叶榕(Ficushirta)、地桃花(Urenalobata)、芒萁(Dicranopterisdichotoma)等为主。天然次生林的在演替前期以是杉木(Cunninghamialanceolata)为主，胸高断面积约为27.69 m2·hm-1，而后期形成以栲树(Castanopsisfargesii)、木荷(Schimasuperba)等当地优势树种为主的阔叶林，胸高断面积约为56.80 m2·hm-1；林下植被主要包括黄瑞木(Adinandramillettii)、榕叶冬青(Ilexficoidea)、狗脊蕨(Woodwardiajaponica)、长刺带叶苔(Pallaviciniasubciliata)等。选用梅花布点法布设样点，样点之间的间隔大于3 m，每个样品选取3个样点，在每个采样点采集0～10 cm表层土壤。土样采集后立即使用冰盒运送至实验室，所有土壤样品过2 mm筛以去除掺杂的碎石及植物碎屑，并于4 ℃保存用于后续实验。

1.2 土壤病毒DNA提取及测序

土壤病毒DNA提取流程参考农田土壤病毒的提取方法并进行相应优化[18]，改进方法简述如下，称取500 g过2 mm筛的新鲜土样，与3 L 1%的柠檬酸钾缓冲液混匀，于150 r·min-1振荡15 min，随后以1 500×g离心10 min，并收集上清液。剩余土壤沉淀再次加入缓冲液进行重悬浮、振荡和离心，重复洗脱3次。随后采用切向流过滤系统(Tangential Flow Filter System，QuixStand，GE Healthcare Life Sciences，Pittsburgh，PA，USA)、30 ku超滤离心管(Merck Millipore Ltd.，Tullagreen，Ireland)进行浓缩。将所得的病毒浓缩液使用DNase I(Promega，Madison，Wisconsin，USA)于37 ℃孵育30 min(20 units·μL-1)，以去除游离的胞外DNA。随后利用Power Viral Environmental RNA/DNA Isolation Kit(Qiagen，Hilden，Germany)提取病毒DNA。选取细菌16S rRNA基因对病毒DNA进行PCR检测(引物27F/1492R)，以确保没有细菌污染[19]，并将病毒DNA于-80 ℃保存[20]。

利用超声破碎仪Covaris M220(Covaris，Woburn，MA，USA)对病毒DNA进行随机打断(长度约350 bp)，随后使用Accel-NGS 1S Plus DNA Library Kit(Integrated DNA Technologies(IDT)Ann Arbor(formerly Swift Biosciences)，Michigan，USA)进行宏病毒组文库构建。利用Nanodrop和Qubit对病毒DNA进行纯度和浓度检测，建库后质检合格的样品进行Illumina HiSeq 2500高通量测序。测序所得宏病毒组原始序列提交至NCBI Sequence Read Archive(SRA)数据库，获得数据收录号。

1.3 宏病毒组数据处理

原始测序数据利用fastp软件以默认参数去除接头与低质量序列，获得clean reads[21]。运用SortMeRNA v2.1去除clean reads中的核糖体序列[22]，利用bbmap与NCBI UniVec数据库(ftp：∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/UniVec,March2017)进行比对，去除可移动遗传元件。然后使用metaSPAdes对clean reads进行组装拼接，得到原始contigs[23]。Clean reads与病毒数据库进行Blastx比对和物种注释(EValue<1e-5，score值>50)[24]，病毒数据库综合了NCBI non-redundant(NR)database，Refseq virus database和PHAST网站上的噬菌体数据库(截至2018年8月)[25]。依据病毒物种注释结果，通过Virus Host DB在线网站进行病毒宿主预测。使用Prodigal v2.6.3以默认参数对比对到的病毒序列进行开放阅读框(ORFs)预测[26]，并将预测得到的蛋白序列与KEGG蛋白数据库进行比对(EValue<1e-5)，利用MEGAN 6对病毒功能进行分类[27]，使用dbCAN meta server在线分析网站对病毒contigs进行CAZyme辅助代谢基因注释[28]。

2 结果与分析

2.1 土壤病毒群落结构

通过宏病毒组测序，从杉木人工林(S40)、天然更新次生林(T40)和原生林(Y100)土壤样品中分别获得20 304 087、25 732 571、32 923 917条clean reads，其中分别有163 339、310 235和468 921条clean reads比对上病毒数据库。将clean reads进行拼接，在杉木人工林、天然更新次生林和原生林土壤宏病毒组中分别得到2 800、6 521和16 990条contigs(>300 bp)。通过与病毒数据库进行比对，结果如图1(a)所示，长尾噬菌体科(Siphoviridae)为原生林和天然更新次生林土壤样品中的主要病毒类群，分别占比62.60%和31.49%，而其在杉木人工林土壤中仅占比16.72%；其次是肌尾噬菌体科(Myoviridae)，在天然更新次生林土壤中占比22.93%，高于其在原生林和杉木人工林中的占比(10.83%和8.33%)。而杉木人工林土壤样品中的主要病毒类群为微小噬菌体科(Microviridae)，占比27.89%，远高于其在原生林和天然更新次生林土壤中的比例(1.52%和1.41%)，其次是长尾噬菌体科(16.72%)。

3种土壤均检测到拟菌病毒科(Mimiviridae)、Phycodnaviridae、短尾噬菌体科(Podoviridae)、环状病毒科(Circoviridae)等。此外，小环状DNA病毒科(Smacoviridae)仅在杉木人工林和天然更新次生林土壤样品中检测到。嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、Lavidaviridae、嗜盐纺锤形噬菌体科(Halspiviridae)仅在杉木人工林和原生林土壤样品中检测到。古噬菌体科(Rudiviridae)、复层噬菌体科(Tectiviridae)仅在天然更新次生林和原生林土壤样品中检测到(图1(b))。在天然更新次生林、杉木人工林和原生林的土壤中均发现了核质巨大DNA病毒成员，包括痘病毒科(Poxviridae)、 虹膜病毒科(Iridoviridae)、囊泡病毒科(Ascoviridae)、藻类去氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)、马赛病毒科(Marseilleviridae)和拟菌病毒科(Mimiviridae)、潘多拉病毒科(Podoviridae)，NCLDV在原生林、天然更新次生林、原生林中的占比依次为9.77%、20.83%、12.20%。

(a)土壤病毒科水平物种组成，(b)共有和特有的病毒科数目韦恩图。 图1 不同更新方式下土壤病毒群落组成Fig.1 Taxonomic compositions of viral communities under different restoration patterns

2.2 病毒宿主分析

图2 病毒宿主分析Fig.2 Host analysis

选取相对丰度最高的长尾噬菌体科、肌尾噬菌体科、微小噬菌体科和拟菌病毒科在Virus Host DB在线网站上进行已知宿主检索，结果见图2，病毒的主要宿主分属于5个细菌门，其中放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)占比最多(74.52%和17.01%)，其次是厚壁菌门(Firmicutes)和双环菌门(Bigyra)(5.13%和2.28%)，变形虫门(Amoebozoa)最少(1.06%)。在属水平上，戈登氏菌属(Gordonia)占比最大(44.85%)，红球菌属(Rhodococcus)和农杆菌属(Agrobacterium)次之(15.38%和8.78%)，此外，还发现了部分致病的分枝杆菌属(Mycolicibacterium)(3.49%)和链霉菌属(Streptomyces)(0.9%)。其中杉木人工林主要宿主为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(39.39%)、农杆菌属(Agrobacterium)(17.49%)，天然更新林为农杆菌属(Agrobacterium)(23.90%)、芽孢杆菌属(Bacillus)(12.00%)，而原生林的主要病毒宿主则为戈登氏菌属(Gordonia)(61.19%)、红球菌属(Rhodococcus)(20.20%)。

2.3 土壤病毒功能

使用Prodigal v2.6.3对病毒contigs进行基因预测[26]，并将预测所得基因蛋白序列与KEGG蛋白数据库进行比对(EValue<1e-5)，利用MEGAN 6对3种土壤病毒进行功能分类(图3)[27-28]。Level 1水平上，3种土壤均注释到4种病毒功能，其中“Metabolism”和“Genetic Information Processing”占比较高，“Environmental Information Processing”和“Cellular Processes”次之。Level 2水平共比对到17个病毒功能，其中“Replication and repair”、 “Amino acid metabolism”和“Nucleotide metabolism”丰度最高，这些功能对病毒的繁殖和存活至关重要。值得注意的是，“Carbohydrate Metabolism”在亚热带森林土壤病毒功能中所占比例较高。

图3 病毒功能注释Fig.3 Functional profile of viromes

为了探究不同更新方式森林土壤病毒在碳循环中的功能，进行了碳水化合物活性酶 (CAZymes)的识别。根据CAZy和NCBI非冗余蛋白(NR)数据库注释结果(图4)，在原生林土壤中注释到的编码病毒CAZyme相关基因丰度最高(210个)，远高于天然次生林(69个)和杉木人工林(4个)，基因注释结果属于辅助氧化还原酶(auxiliary activities，AA)、碳水化合物结合模块(Carbohydrate-binding modules，CBM)、碳水化合物酯酶(Carbohydrate esterases，CE)、糖苷水解酶(Glycoside hydrolases，GH)和糖基转移酶(Glycosyl transferases，GT)5个CAZyme功能类型，其中糖苷水解酶的比重最高(78.45%)，糖基转移酶次之(16.25%)，辅助氧化还原酶、碳水化合物酯酶和碳水化合物结合模块占比最低(2.83%、1.77%和0.71%)。基因水平上，GH24、GH23和GH13基因丰度最高(23.67%、19.43%和9.19%)，有152个基因属于溶菌酶或几丁质酶，其余基因包括α-淀粉酶、纤维素合成酶等。在原生林和天然更新次生林中主要发现的CAZymes为糖苷水解酶(88.57%、47.83%)，在天然更新次生林中也有相当比例的糖基转移酶(39.13%)，而在杉木人工林中仅发现CBM50、GH24、GH32、GH73。

3 讨论

宏病毒组物种注释结果表明，原生林、天然更新次生林、杉木人工林土壤病毒群落呈现显著差异。原生林和天然更新次生林中dsDNA病毒占优势，而在杉木人工林中占比最高的则为ssDNA病毒。其中有尾噬菌体目长尾噬菌体科在3个森林土壤中均为主要病毒类群。相关研究表明，长尾噬菌体科在红树林[17]、马尾松林[29]、城市森林[30]等不同森林类型中均为优势分类单元。长尾噬菌体非经典的DNA聚合方式使宿主细菌的免疫系统无法识别该噬菌体基因组，从而增加侵染效率并维持自身基因组的稳定，这种特殊的DNA聚合方式可以解释其在环境中大量存在的原因[31]。而在杉木人工林中微小噬菌体病毒科的占比显著增加。微小噬菌体科的宿主主要为肠杆菌科和专性寄生菌[32]，且在感染周期中的潜伏期短、子代释放量大[33]，从而广泛分布于环境中，如海洋、污水、人体肠道和沉积物等。杉木林人工林中高比例的微小噬菌体科可能是因为人类的活动为微小噬菌体提供了更丰富的宿主[34]。

NCLDV是一组多样的真核病毒，感染广泛的真核生物，特别是原生生物和藻类，最大的巨型病毒在颗粒和基因组大小上都超过了许多细菌和古菌[35]。相关土壤病毒研究挖掘到了高度多样的巨型病毒，并发现许多NCLDV能够编码糖酵解和三羧酸循环的成分，证明NCLDV是全球生物地球化学循环的重要驱动因素[36]。本研究未调查其他微生物分类群，而且并未有相关研究对土壤特征及生态管理实践如何影响NCLDV组成进行探究，因此无法充分讨论不同更新方式下NCLDV相对丰度的差异，但可以肯定的是NCLDV广泛分布在不同环境土壤中[36-37]。

噬菌体调控细菌群落结构是一种经典的Top-down调控。近来相关研究发现森林土壤病毒主要对R-策略细菌进行靶向裂解，释放出细胞内高生物利用度的溶解性有机物，并促进其他异养微生物的增长[38]。本研究匹配到的主要病毒宿主包括放线菌门、变形菌门和厚壁菌门，其均为R-生存对策[39]，因此亚热带森林中土壤病毒很可能通过裂解宿主释放营养物质进而影响碳循环。不同更新方式下亚热带森林土壤病毒宿主在门和属水平均具有差距，但是其宿主都包括相当比例的致病菌如戈登氏菌、红球菌、分枝杆菌等，因此土壤病毒还可能影响不同更新方式土壤的抑病能力。

亚热带森林是北半球相当大的碳汇[40]，在森林生态系统中，很大一部分有机碳以复合碳水化合物的形式储存在土壤、动植物残体中，极难降解[41]。因此，土壤和生物碎片中复杂多糖的生物分解对于亚热带森林物质循环至关重要。土壤病毒能够介导基因的水平转移，这些辅助代谢基因(Auxiliary metabolic genes，AMGs)可以在病毒侵染宿主后在宿主胞内表达，改变宿主代谢过程，从而参与元素的生物地球化学循环[42]。科学家在消融的永久冻土[43]、红树林土壤[17]、农田土壤[44]的病毒组研究中均发现土壤病毒携带大量碳循环相关的AMGs，本研究同样发现了土壤病毒携带编码CAZymes的碳循环基因，且在不同森林更新方式下差异显著。天然更新林与单一人工林相比，具有更高的微生物生物量[45]、凋落物质量[46]以及更丰富的植被多样性[47]和根系分泌物[48]，因此土壤中有机碳组成更为复杂。与碳水化合物转运和代谢相关的基因在发育成熟的原生林以及天然更新次生林土壤病毒中更为富集，这表明了微生物群落随环境变化的功能适应，以利用由于植物和其他微生物群落的生长而在土壤中积累的不同C源，如纤维素、半纤维素、淀粉、果胶和几丁质等。因此，在维持微生物C循环相关功能方面天然更新方式更具优势。

4 结论

通过宏病毒组学方法分析了不同更新方式下闽西亚热带森林土壤病毒的群落组成和功能特征。研究表明不同管理方式下土壤病毒群落组成存在显著差异，原生林和天然更新次生林主要以长尾噬菌体科、肌尾噬菌体科为主，而杉木人工林中最优势的病毒科则为微小噬菌体科。3种土壤中均发现了NCLDV，其中在天然更新次生林中占比最大。病毒宿主检索的结果表明3种土壤中病毒宿主具有差异，变形菌门为杉木人工林和天然更新次生林中最主要的病毒宿主，而原生林则为放线菌门，但不同更新方式土壤病毒宿主都包括相当一部分人和动物的致病菌。这些结果说明土壤病毒群落组成可能受到与不同森林更新方式相关的人类和动物活动的影响。

在不同更新方式森林土壤病毒中鉴定的CAZymes基因丰度具有显著差异，其中杉木人工林中仅发现4个CAZymes基因，这揭示了土壤病毒具有通过基因的水平转移影响森林碳循环的潜力以及天然更新方式在恢复微生物C功能多样性方面更具优势。未来研究者还需要在天然更新林和人工林不同演替梯度上采集更丰富的样品，进一步从土壤病毒的角度来剖析不同森林管理方式的优劣势。