林分类型对亚热带森林土壤团聚体中真菌反硝化微生物丰度的影响

邓米林，林永新，叶桂萍，胥 超，宛 颂，贺纪正

(1.福建师范大学湿润亚热带山地生态国家重点实验室培育基地，福建 福州 350117；2.福建师范大学地理科学学院，福建 福州 350117；3.闽江学院地理与海洋学院，福建 福州 350108；4.福建三明森林生态系统与全球变化国家野外科学观测研究站，福建 三明 365000)

森林是陆地生态系统的主要组成部分，约占全球陆地面积的27.7%[9]。森林土壤可以作为大气中N2O的源或汇，在调节全球气候变化的过程中发挥着至关重要的作用[9]。我国湿润亚热带地区森林广布，约占全国森林总面积的34%，且该地区属于典型的季风气候，水分饱和，土壤高度风化呈酸性，是全球最大的N2O天然来源之一[10]。Zhang等[11]认为，真菌可能是亚热带森林土壤N2O的潜在重要排放源。Wu等[12]研究发现，亚热带森林土壤的真菌群落比温带森林土壤更丰富。Prendergast-Miller等[13]指出，菌根真菌可以产生N2O，表明真菌在森林土壤N2O产生过程中发挥重要作用。章伟等[14]研究发现天然林土壤真菌反硝化活性高于细菌，但对产生N2O的贡献与细菌相当。Chen等[15]对人工林和废弃农田等多个生态系统进行研究发现，真菌对不同生态系统土壤N2O的产生均有很大贡献，且在酸性人工林中贡献更高。尽管前人已对森林土壤真菌反硝化过程开展了部分研究，但大多数研究只关注真菌对N2O排放量的贡献，而对产生N2O的关键基因FnirK及其影响因素的研究极其匮乏。此外，团聚体作为土壤的重要分类单元和功能调节器，可为微生物的定居提供合适的微环境。但目前关于团聚体中真菌反硝化微生物的研究甚少。Lin等[16]对长期施肥的农田土壤研究发现粒径较小的团聚体(<0.053 mm和0.053～ <0.25mm)中FnirK丰度高于较大团聚体(0.25～2 mm和> 2 mm)。那么，FnirK在森林土壤不同粒径团聚体中如何分布？不同林分类型是否会通过影响团聚体粒径大小从而影响FnirK基因丰度？不同粒径团聚体中FnirK基因丰度对林分类型的响应是否存在差异？目前尚不清楚。

基于以上研究背景，本研究选取了3种典型亚热带森林土壤：米槠次生林、杉木人工林和马尾松人工林，利用荧光定量PCR，分析不同林分类型对土壤团聚体中真菌反硝化微生物功能基因FnirK丰度的影响，以期为亚热带森林管理和N2O温室气体减排提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

研究区位于福建省三明市森林生态系统与全球变化研究站陈大观测点(26°19′N，117°36′E)。该地区以丘陵和山地为主，属于亚热带海洋性季风气候，年平均气温19.1 ℃，相对湿度81%，年平均降水量1 749 mm，且主要集中在3月至8月之间。研究区土壤由花岗岩发育而成，属于红壤。近200多年里，米槠天然林一直是该地区的优势种。除米槠外，该地区还包含格式栲(Castanopsiskawakamii)、木荷(Schimasuperba)、桂北木姜子(Litseasubcoriacea)、杜英(Elaeocarpusdecipiens)等物种。米槠次生林由米槠天然林在1976年经过高强度的选择性砍伐后自然再生而成；杉木人工林和马尾松人工林在同一时间由米槠天然林经过砍伐、焚烧后人工种植幼苗长成。米槠次生林、杉木人工林、马尾松人工林的平均树高分别为13.7、18.2、18.3 m，平均胸径分别为16.8、15.6、18.3 cm，林分密度分别为2 158、2 858、1 500株·hm-2[17]。

1.2 样地设置与样品采集

土样采集于2022年1月，在米槠次生林(SF)、杉木人工林(CF)和马尾松人工林(PF)坡度均匀的地段分别选取4块20 m×20 m样方，共计12块样方。刨除表面杂草和凋落物，用铁锹铲下0～10 cm深的土块，每块呈三角状间隔3 m左右分别取3份土壤混合成一个重复，共计12份样品。对采集的全土(bulk soil)用自封袋包好后放入塑料方盒保鲜，防止运输途中破坏团聚体结构，在实验室过8 mm筛后挑去碎石、细根和凋落物等杂质，随后分为4份，其中1份用于团聚体的筛分，其余3份过2 mm筛后分别进行风干、保存于4 ℃和-80 ℃冰箱，分别用于理化性质、反硝化潜势测定和分子生物学试验。

1.3 土壤理化性质测定和团聚体分级

土壤pH值、总有机碳、可溶性有机碳、铵态氮、硝态氮、全氮、有效磷和土壤含水率的测定方法参照邓米林等[18]进行。团聚体的筛分参考Elliott[19]进行，采用湿筛法将土壤团聚体分为4种粒径：大团聚体(>2 mm)、小团聚体(0.25～2 mm)、微团聚体(0.053～<0.25 mm)和粉-黏颗粒(<0.053 mm)。将得到的各组分进行冷冻干燥后计算质量分数，随后保存于-80℃冰箱用于分子生物学试验。

1.4 土壤反硝化潜势的测定

反硝化潜势(PD)参照王梦娟等[20]所述方法进行，即称取(10±0.05) g(烘干称质量)新鲜土样于300 mL玻璃培养瓶中，盖上封口膜后放置于25 ℃恒温恒湿培养箱中过夜预培养24 h。取出后向瓶中加入20 mL去离子水，摇匀后盖上带三通阀的瓶盖，用高纯氮气反复冲洗培养瓶直至形成无氧环境，用注射器抽取30 mL高纯乙炔代替瓶内顶空气体。置于恒温振荡培养箱25 ℃，100 r·min-1培养12 h。培养过程中于0、6、12 h用针筒采集瓶内上方气体5 mL，用气相色谱仪(GC2030，岛津，日本)测定N2O气体浓度，反硝化潜势根据采集气体的N2O浓度和时间的一次方程斜率计算[21]。

1.5 土壤总DNA提取和荧光定量PCR

称取0.5 g保存于-80 ℃冰箱的全土和冷冻干燥后的各粒级团聚体组分，按照FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒的操作说明，提取土壤总DNA，利用实时荧光定量PCR(Bio-Rad Laboratories，Harcules，美国)测定FnirK基因的丰度。引物序列、反应体系、反应条件和标准曲线的制作参照Lin等[16]。根据标准曲线计算FnirK的拷贝数，通过琼脂糖凝胶电泳检验扩增后的产物有无非特异性扩增。溶解曲线为单峰，扩增效率为126.5%，R2为0.996。

1.6 数据处理与分析

采用SPSS 23.0软件进行数据分析。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)研究不同林分类型对土壤理化性质、团聚体结构、FnirK基因丰度和反硝化潜势的影响，以及土壤团聚体对FnirK基因丰度的影响。利用LSD检验差异显著性(α=0.05)。采用双因素方差分析(two-way ANOVA)比较不同林分类型和团聚体大小对FnirK基因丰度的影响。利用Pearson相关性分析FnirK基因丰度和反硝化潜势与土壤理化性质之间的相关性。采用Origin 2021软件作图。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质和团聚体结构

由表1可以看出，杉木人工林和马尾松人工林土壤pH显著高于次生林。次生林土壤铵态氮含量显著高于杉木人工林和马尾松人工林，有效磷和含水率均显著低于马尾松人工林，但与杉木人工林无显著差异。3种林分土壤大团聚体和小团聚体占比较高，小团聚体和粉-黏颗粒占比较低(表2)。除次生林土壤小团聚体占比高于杉木人工林外，不同林分类型土壤团聚体组成均无显著差异。

表1 不同林分类型土壤理化性质和FnirK基因丰度Tab.1 Soil physicochemical properties and FnirK gene abundance in different forest types

表2 林分类型对土壤团聚体粒径分布比例的影响Tab.2 Effects of forest types on the particle size distribution ratio of soil aggregates %

2.2 土壤团聚体FnirK基因丰度和土壤反硝化潜势

由表1可以看出，马尾松人工林全土FnirK基因丰度最高，为5.30×108copies·g-1，显著高于杉木人工林土壤的2.49×108copies·g-1和次生林土壤的1.21×108copies·g-1。土壤团聚体各粒级的FnirK基因丰度呈现同样趋势：马尾松人工林>杉木人工林>次生林(图1)。双因素方差分析表明，林分类型显著影响FnirK基因丰度(P<0.001)，而团聚体大小及其交互作用对FnirK均无显著影响(表3)。与次生林相比，天然林转变为杉木人工林显著增加了微团聚体和大团聚体中FnirK基因丰度；天然林转变为马尾松人工林显著增加了4种粒级团聚体中FnirK基因丰度。此外，马尾松人工林和杉木人工林土壤具有较高的反硝化潜势，分别为10.23和6.41 μg·kg-1·h-1，显著高于次生林土壤的2.76 μg·kg-1·h-1。相关性分析表明，反硝化潜势与土壤pH值和FnirK基因丰度显著正相关(图2)。FnirK基因丰度和反硝化潜势与土壤可溶性有机碳含量呈显著负相关，与有效磷含量和含水率均呈显著正相关。

不同大写字母表示相同粒径不同林分类型之间差异显著；不同小写字母表示同一林分不同粒径之间的差异显著(P<0.05)。图1 不同林分类型土壤团聚体中FnirK基因丰度Fig.1 The abundance of FnirK gene in soil aggregates of different forest types

表3 林分类型和团聚体粒径及其交互作用对土壤FnirK基因丰度影响的双因素方差分析Tab.3 Two-way analysis of variance (ANOVA)of the effects of forest type，aggregate size and their interactions on FnirK gene abundance

3 讨论

土壤基本理化性质如pH值、含水率、有效磷以及碳氮有效性等是调控土壤微生物的丰度、多样性和群落组成的主要非生物因子[22-25]。本研究结果表明，不同林分土壤团聚体组成无显著差异，这可能是由于团聚体结构与土壤有机质含量密切相关，而3种林分土壤有机碳含量无显著差异，因此3种林分团聚体组分无显著差异[17]。不同林分类型显著影响土壤理化性质和FnirK基因丰度。其中，杉木人工林和马尾松人工林土壤FnirK基因丰度较高，次生林土壤较低。原因可能如下：(1)人工林土壤经过营林改造等措施，土壤贮水性能更好，土壤含水量长期高于次生林，更有利于反硝化真菌的生长[22，26]。(2)杉木人工林和马尾松人工林土壤有效磷含量较高，从而有利于提高土壤真菌丰度和多样性[27-28]。(3)pH值的变化通常会影响土壤中大多数微生物的生存，在酸性的森林土壤中，pH值升高往往有利于微生物的生长[26，29]。本研究中，杉木人工林和马尾松人工林土壤pH值显著高于次生林(表1)，可能是人工林土壤FnirK丰度较高的部分原因。(4)不同植被类型，其凋落物数量、成分、有机质含量、土壤养分以及根系分泌物等均存在较大差异，对微生物生长具有选择刺激性作用，本研究采样点位于中亚热带地区，气候湿润多雨，人工林植被多样性和凋落物量较次生林低，表层土壤养分易随雨水流动，更利于微生物生长[30]。本研究结果表明，不同林分类型土壤团聚体结构无显著差异，但杉木人工林和马尾松人工林土壤各团聚体中FnirK基因丰度均高于次生林。总体而言，次生林土壤4种粒径团聚体中FnirK基因丰度无显著差异，但杉木人工林和马尾松人工林土壤FnirK在2种较大粒径团聚体中分布较多，在2种较小粒径团聚体中分布较少(图1)。这与细菌反硝化nirK和nirS的分布特征一致[18]。这可能是因为人工林土壤具有较高的水分和有效磷含量，提高了土壤各团聚体组分的FnirK基因丰度[27]。此外，由于人工林表层土受人为干扰较强，且相较于粉-黏颗粒，较大团聚体受到环境变化的影响更大[29]，因此人工林土壤2种较大团聚体FnirK基因丰度较高。此外，研究表明，粒径较大的两种团聚体中有机碳和总氮的浓度往往高于粒径较小的团聚体，且易于分解，因此，当人工林土壤理化性质如pH值、有效磷和含水量等更高时，较大团聚体更有利用微生物对养分的利用[31]。双因素方差分析结果表明，林分类型显著影响FnirK基因丰度，但团聚体结构对FnirK基因丰度无显著影响(表3)。然而，在先前的研究中发现，林分类型和团聚体粒径均显著影响细菌nirK和nirS基因丰度[18]。因此，相比于细菌，真菌可能更不易受土壤团聚体粒径大小的影响。

本研究中，杉木人工林和马尾松人工林土壤反硝化潜势均显高于次生林(表1)。这可能是因为，相较于次生林，人工林土壤具有更高的nirK、nirS和FnirK丰度，细菌和真菌反硝化活性更强，反硝化作用产生更多的N2O[26]。尽管真菌和细菌在进行反硝化作用产生N2O的过程中都更偏好缺氧、中性或碱性的环境，但先前的多项研究表明，当pH值介于4～8时，真菌通常比细菌更能耐受酸性，且较于其他生态系统，林地中的真菌更丰富[15，32]。3种林分土壤反硝化潜势与FnirK基因丰度呈显著正相关(图2)，因此，在酸性的森林土壤中，含nirK基因的真菌可能比细菌在产生N2O的过程中发挥着更重要的作用，这与前人研究结果相似[33-35]。此外，FnirK基因丰度和反硝化潜势与土壤含水率和有效磷含量显著正相关(图2)，表明不同林分类型主要通过影响土壤有效磷含量和含水率来影响真菌反硝化功能基因FnirK丰度，从而影响真菌反硝化产生N2O。此外，反硝化潜势还与土壤pH值呈显著正相关(图2)，这可能是由于细菌反硝化的作用[18]。本研究选取的3种林分土壤pH值均在5左右，细菌反硝化作用受限，先前研究已发现细菌nirK和nirS丰度在不同林分类型土壤中的分布特征主要受pH值和铵态氮含量的影响[18]，因此反硝化潜势对pH值的响应可能主要源于细菌反硝化。综上，亚热带酸性森林土壤中反硝化真菌对林分类型的响应特征不同于反硝化细菌，主要受控于土壤有效磷和含水率。

4 结论

不同林分类型土壤团聚体结构无显著差异，但杉木人工林和马尾松人工林土壤和团聚体中FnirK基因丰度以及反硝化潜势均高于次生林。FnirK基因丰度受林分类型显著影响，而受团聚体粒径大小影响较小。FnirK基因丰度在次生林土壤4种粒径团聚体中无显著差异，但在杉木和马尾松人工林土壤大团聚体和小团聚体中相对较高，微团聚体和粉-黏颗粒中较低。不同林分类型主要通过影响土壤含水率和有效磷含量来影响FnirK基因丰度，从而影响土壤反硝化潜势。因此，建议未来在森林管理过程中，应尽量减少人工林种植，让其自然演替，以减少温室气体N2O排放。