垄作灌溉和减施氮肥对稻田CH4 排放、土壤有机酸含量和酶编码基因表达量的影响

李熠凡，李伏生，罗维钢，黄 挺

(1 广西大学 农学院,广西 南宁 530005；2 南宁市灌溉试验站,广西 南宁 530001)

甲烷(CH4)是仅次于二氧化碳(CO2)的第二大温室气体，其增温效应对全球温室效应的贡献率高达17%[1]。稻田系统是农田土壤CH4的重要排放源，而合理灌溉方式和施肥管理是降低稻田温室气体排放和温室效应的主要措施。水稻淹水栽培模式不仅耗水量较大，还导致稻田产生大量CH4[2-3]，是CH4的主要人为排放源。垄作灌溉是稻田在平作基础上，经起垄，利用垄沟中储存的自然降雨以及灌溉水，在水稻生长过程中进行浸润灌溉[4]。垄作灌溉在减少灌水量的同时可降低稻田CH4累积排放量[5]。与淹水灌溉相比，垄宽为80 cm 的垄作灌溉稻田CH4排放量减少45.6%～70.3%[6]。

过量施入氮肥会导致氮素利用效率降低，土壤污染加重，硝态氮淋溶增强，对土壤环境造成极大威胁[7]。胡敏杰等[8]认为较高氮肥用量会增加根系和地上生物量，使土壤碳氮比提高，为产CH4菌提供更多的有机底物，同时短期内刺激土壤微生物活性，促进土壤有机质分解，从而促进CH4排放。姜珊珊等[9]研究发现，减施氮肥可以减少稻麦农田温室气体排放，实现减排。适宜的施氮量改善CH4氧化菌的氮缺乏状态，有利于CH4氧化菌的生长繁殖，提高CH4排放氧化能力，从而降低CH4排放。适宜的施氮量可以降低稻田CH4排放[10-11]，因此在保证产量的同时，寻找合理的减氮量对稻田CH4减排很有必要。

根系分泌有机酸总量、苹果酸和琥珀酸含量与土壤供氮量呈正效应[12]。稻田CH4排放与土壤有机酸含量有一定关系。目前已知CH4产生途径之一是产CH4菌在厌氧条件下将土壤有机物分解转化为乙酸、H2和CO2等[13]。与淹水灌溉相比，干湿交替灌溉对稻田土壤中的产CH4古菌种群丰度没有显著影响，但却显著改变了土壤中产CH4菌的群落结构[14]。产CH4古菌中甲基辅酶M 还原酶(Methyl coenzyme M reductase，MCR)是CH4形成的关键酶，其编码基因为mcrA[15]，而甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase，MMO)是CH4氧化的关键酶[16]，有sMMO 和pMMO 2 种形式，编码基因分别为sMMO和pMMO，是产CH4菌和CH4氧化菌丰度估算的分子标记。Yuan 等[17]结合高通量测序和qPCR 等技术，通过CH4合成和氧化过程中的关键酶编码基因表达量估算产CH4菌及CH4氧化菌丰度，发现还原途径的乙酸裂解途径的甲烷鬃菌属Methanosaeta为稻田产CH4核心菌群，其群落组成与土壤草酸、乙酸和琥珀酸等有机酸密切相关。

目前有关垄作灌溉对稻田CH4通量、土壤有机酸和CH4形成和转化相关酶编码基因表达量的影响以及相互关系研究较少，前人在研究减施氮肥对稻田CH4排放的影响上，取得的结论也尚不一致，有待进一步探讨。为探索垄作灌溉与减施氮肥结合下稻田CH4排放、土壤有机酸和CH4形成和转化相关酶编码基因表达量之间的相互关系，通过田间试验，研究不同垄面宽度的垄作灌溉与水稻返青期和孕穗期减施氮肥对稻田土壤CH4排放、土壤有机酸与CH4形成和转化相关酶编码基因表达量的影响，分析不同垄作灌溉模式与施氮处理下土壤有机酸和酶编码基因表达量对稻田CH4排放的影响。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

大田试验于2020 年8 月在南宁市灌溉试验站(N22°52′58.33″、E108°17′38.86″)进行。返青期(移栽后0—7 d)、分蘖期(移栽后8—38 d)、拔节孕穗期(移栽后38—57 d)、抽穗期(移栽后57—70 d)和成熟期(移栽后71—95 d) 降水量分别为74.0、45.0、70.5、56.5 和13.5 mm。试验土壤为第四纪红色黏土发育的水稻土，主要理化性质如下：pH 7.069(水、土质量比2.5∶1.0，pH 计法)；有机碳16.58 g·kg-1(重铬酸钾容量法-外加热法)；全氮1.35 g·kg-1(半微量开氏法)；碱解氮100.6 mg·kg-1(1 mol·L-1NaOH 碱解扩散法)；速效磷55.38 mg·kg-1(0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-钼兰法)；速效钾116.65 mg·kg-1(1 mol·L-1NH4OAc 浸提-火焰光度法)[18]。供试水稻品种选用当地推广的‘甬优4 949’，属三系籼粳杂交中稻品种。

1.2 试验方法

试验设3 种灌溉模式——淹水灌溉、垄宽80 cm 的垄作灌溉(垄灌80)、垄宽100 cm 的垄作灌溉(垄灌100)，和3 种施氮处理——常规施氮、返青期减氮、孕穗期减氮，共9 个处理，每个处理设3 个小区，各小区面积25 m2。淹水灌溉在水稻整个生育期内保持20～40 mm 水层。垄作灌溉是在移栽前起垄，形成需要的垄面和垄沟，垄沟宽度和深度分别为20 和15 cm，根据生育期沟内灌水水层要求，插秧前将沟内水灌溉到高出垄面10 mm，然后插秧，此后生育期内，垄面水层在0～10 mm 循环，实现垄作灌溉。分蘖后期将沟内水灌至与垄面齐平，保持沟内至少有1/4 水层，拔节孕穗期到成熟期垄面保持10 mm 水层，成熟期将沟内水灌至与垄面齐平，等沟内降至1/4 水层时，再将沟内水灌至与垄面齐平，如此循环，实现垄作灌溉，具体灌溉方式参照Zeng 等[6]的方式。降雨时田面和垄沟水层可以增加10～30 mm。3 种施氮处理纯氮用量分别为常规施氮：135 kg·hm-2，其中苗肥47.25 kg·hm-2、分蘖肥54.00 kg·hm-2和穗肥33.75 kg·hm-2；返青期减氮：110 kg·hm-2，其中苗肥22.25 kg·hm-2、分蘖肥54.00 kg·hm-2和穗肥33.75 kg·hm-2；孕穗期减氮：110 kg·hm-2，其中苗肥47.25 kg·hm-2、分蘖肥54.00 kg·hm-2和穗肥8.75 kg·hm-2。试验氮、磷、钾肥分别使用尿素[w(N)46%]、过磷酸钙[w(P2O5)14%]、氧化钾[w(K2O)60%]。各处理P2O5用量均为60 kg·hm-2(100% 基肥)，K2O 用量均为120 kg·hm-2(60%苗肥、40%穗肥)。为防止试验小区间水分侧渗、保证各小区独立排水，小区间用水泥墙隔离分开，各小区均用水管引入固定水源、安装水表并计量灌水量。

试验于2020 年8 月9 日进行大田移栽(选取长势均匀的秧苗单株栽培，株行距为20 cm×20 cm)，8 月16 日施苗肥(移栽后6 d)，9 月3 日施分蘖肥(移栽后21 d)，9 月24 日复水后施穗肥(移栽后42 d)，11 月14 日水稻收割。整个试验大田生育期为95 d。

1.3 CH4 气体采集和测定

用静态封闭箱法在田间采集稻田土壤及稻株共同排放的CH4气体[19]。静态箱箱体为无底圆柱体，由厚5 mm 的亚克力板制成，箱体直径25 cm、高80 cm，顶部封闭留采气孔，底部开口端为锯齿状，静态箱内部安装可充电风扇。取样时静态箱垂直插入土壤中不留空隙，保证箱内气体与外部大气不交换。采样前将箱体内风扇打开，均匀混合气体，再用注射器采集气体样品。不同时期稻田CH4通量的变化从水稻移栽后开始采样，根据水分变化情况每隔5～7 d 采样1 次，在施用氮肥后7 d 内连续采样3 次。采样时刻为09:00—12:00，同时记录箱温和采样器高度。每个采样点在盖箱后0、10、20 和30 min 时用注射器采样，每次样品量为20 mL。

CH4通量采用气相色谱仪Agilent 7890A 手动进样测定，采用FID 检测器，检测温度为350 ℃，柱温6 0 ℃，H2发生器制备的H2(流速为4 0 mL·min-1) 与空气混合点火，载气为高纯N2。CH4通量计算公式[20]如下：

式中，F为CH4通量，mg·m-2·h-1；H为实测箱体高度，cm；M为CH4的摩尔质量分数，16 g·mol-1；P为标准大气压，1.013×105Pa；R为气体常数，8.314 J·mol-1·kg-1；θ是采样30 min 箱体内的平均温度，℃；dc/dt为CH4排放速率，mL·m-3·h-1。

CH4累积排放量计算公式[21]如下：

式中，SUM 为CH4累积排放量，kg·hm-2；i为气体采样次数；ti+1-ti表示2 个相邻测定日期的间隔时间，n为CH4累积排放量观测时间内总测定次数。

1.4 土壤采集和测定

在水稻移栽后20、25、30、43、45、46 和71 d 采集CH4的同时，用采土器采集每小区0～20 cm土层的非根际土壤。将新鲜土壤(约100 g)放入提前灭菌过的离心管中，用冷冻干燥机干燥2 d，保存在-80 ℃超低温冰箱，用于土壤有机酸和CH4形成和转化相关酶编码基因表达量的测定。

采用外标法测定土壤有机酸含量[22-23]，将土壤样品从-80 ℃冰箱取出，用冷冻干燥机在-40 ℃对土壤样品进行冷冻干燥。干燥完毕后，放入小钢珠密封离心管研磨、粉碎土样。在土壤样品中加入0.5 mol·L-1NaHCO3缓冲液，经研磨仪震荡、静置后离心，取上清液，用水相针式过滤器过滤至2 mL 进样瓶，得到待测样品，采用上海伍丰液相色谱仪LC100(进样针设置取20 μL)进行测定。配制不同浓度的有机酸标准母液，上机，根据不同浓度有机酸的峰面积绘制每种有机酸的标准曲线，稀释有机酸标准母液得到有机酸标准混合液，上机测定得到有机酸标准色谱图，以标准色谱图作为对照，根据保留时间确定土壤样品中的各种有机酸，并根据标准曲线计算土壤样品中的有机酸含量。总有机酸含量为草酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和富马酸含量的总和。

酶编码基因表达量：采用qPCR 分别在水稻不同生长时期测定稻田CH4产生与转化相关酶编码基因的表达量。通过SDS、CTAB、苯酚-氯仿-异戊醇和异丙醇试剂震荡离心后提取RNA。采用TaKaRa 反转录试剂盒PrimeScript™ RT Master Mix 得到cDNA，采用TaKaRa 试剂盒TB Green®Premix Ex Taq™ I 进行qPCR，仪器为Roche LC 480，由系统完成熔解曲线及荧光检测，并由系统自带软件(SDS 2.3)完成所测定样品的CP值计算[24-25]。

将产CH4古菌的酶编码基因mcrA和sMMO进行qPCR，通过Abs Quant/Fit Points 分析得出CP值，分别与内参基因古菌A16sRNA 和细菌U16sRNA 的CP值相比，可看出酶编码基因mcrA和sMMO的相对表达量。

1.5 统计方法

本研究用Excel 2021 对试验数据进行整理作图。本研究仅对稻田CH4累积排放量进行了方差分析。不同处理间稻田CH4累积排放量和土壤总有机酸含量的多重比较用Duncan’s 法，差异显著性水平为P＜0.05。用Pearson 相关系数表示稻田CH4通量、土壤总有机酸含量和酶编码基因表达量之间的相关性。方差分析、多重比较和Pearson 相关性用SPSS 23.0 软件分析。

2 结果与分析

2.1 垄作灌溉与减施氮肥下稻田土壤总有机酸含量的变化规律

由图1 可知，不同处理土壤总有机酸含量为80.4～133.6 mol·kg-1。其中垄灌80+常规施氮处理在施肥后10 d 土壤总有机酸含量较施肥前高71.7%，淹水灌溉+常规施氮处理高28.8%。返青期减氮下，垄灌80 和垄灌100 土壤总有机酸含量整体低于淹水灌溉，其中移栽后30 d 垄作灌溉土壤总有机酸含量较淹水灌溉分别低13.1%和5.8%。常规施氮下，移栽后20、25 d 垄作灌溉土壤总有机酸含量较淹水灌溉低，而移栽后30 d 高。孕穗期减氮下，移栽后45 d 垄作灌溉土壤总有机酸含量较淹水灌溉低。垄灌80 和淹水灌溉下，在移栽后25 d 返青期减氮土壤总有机酸含量高于常规施氮，垄作灌溉下，孕穗期减氮土壤总有机酸含量在施孕穗肥后整体低于常规施氮。

图1 垄作灌溉与不同时期减施氮肥下稻田土壤总有机酸含量的变化Fig.1 Changes of total organic acid content in paddy soil under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

2.2 垄作灌溉与减施氮肥下稻田酶编码基因表达量的变化规律

图2 是垄作灌溉和不同时期减施氮肥下稻田土壤产CH4古菌中MCR 编码基因mcrA的表达结果。除移栽后71 d 土壤mcrA表达量未测出外，其余天数不同处理土壤mcrA相对表达量在0.09～0.76。由图2 可知：各处理土壤mcrA表达量总体呈现为分蘖后期增加后降低，随后拔节孕穗期又增加的趋势，3 种施氮处理土壤mcrA表达量均在移栽后45 d(拔节孕穗期)最低。由图2a 可知，返青期减氮下，垄灌80 和淹水灌溉土壤mcrA表达量在移栽后25 d 达到峰值，而垄灌100 土壤mcrA表达量在移栽后30 d 最高。3 种灌溉模式下土壤mcrA表达量均在移栽后46 d 出现第2 个小高峰。移栽后45 d 土壤mcrA表达量降低，随后上升；推测可能是因为分蘖末期至孕穗期晒田，土壤氧气条件充足，抑制了产CH4菌活性，从而降低土壤mcrA表达量。返青期减氮下，垄灌80 土壤mcrA表达量均低于淹水灌溉，其中移栽后20 d 垄灌80 土壤mcrA表达量较淹水灌溉低12%。常规施氮下，移栽后20、25 d垄作灌溉土壤mcrA表达量较淹水灌溉低，而移栽后30 d 高。孕穗期减氮下，移栽后45、46 d，垄作灌溉土壤mcrA表达量均较淹水灌溉低。垄灌80 下，在移栽后20、30、43 和45 d，返青期减氮土壤mcrA表达量均低于常规施氮。

图2 垄作灌溉和不同时期减施氮肥下稻田土壤甲基辅酶M 还原酶编码基因mcrA 表达量Fig.2 Methyl coenzyme M reductase encoding gene mcrA expression level in paddy soil under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

图3 是垄作灌溉和不同时期减氮下稻田土壤CH4氧化菌中MMO 编码基因sMMO表达量结果，不同处理土壤sMMO相对表达量为0.59～1.16。由图3 可知，返青期减氮下，垄灌100 和淹水灌溉土壤sMMO表达量在移栽后25 d 达到峰值，垄灌80 土壤sMMO表达量除移栽后25 d 外均高于淹水灌溉，移栽后25 d 垄灌80 土壤sMMO表达量较淹水灌溉低18%。常规施氮下，垄灌100 和淹水灌溉土壤sMMO表达量均在施分蘖肥后开始上升随后下降，移栽后20 d，垄灌80 和垄灌100 土壤sMMO表达量较淹水灌溉分别增加24.8% 和7.0%，而移栽后25 d，垄灌80 和垄灌100 较淹水灌溉分别低30.0%和11.8%。孕穗期减氮下，3 种灌溉模式土壤sMMO表达量均在施分蘖肥、孕穗肥后上升随后下降，移栽后46 d 垄作灌溉土壤sMMO表达量均较淹水灌溉高。垄灌80 下，移栽后20、25 和45 d，返青期减氮土壤sMMO表达量均高于常规施氮。淹水灌溉下，在移栽后25、45 和46 d，孕穗期减氮土壤sMMO表达量整体低于常规施氮。

图3 垄作灌溉与不同时期减施氮肥下土壤CH4 单加氧酶编码基因sMMO 表达量Fig.3 CH4 monooxygenase encoding gene sMMO expression level in paddy soil under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

2.3 垄作灌溉与减施氮肥稻田CH4 排放特征

图4 是垄作灌溉和不同时期减施氮肥下稻田CH4通量的变化情况，整体呈下降趋势。返青期减氮下，垄作灌溉稻田CH4通量均在施分蘖肥后有增加趋势，垄灌100 稻田CH4通量受施肥影响较大，在移栽后30 d 最高，淹水灌溉稻田CH4通量在移栽后20 d 最高。常规施氮下，3 种灌溉模式稻田CH4通量均在移栽后20 d 最高，随后稻田CH4通量降低；移栽后20、25 和30 d，垄作灌溉稻田CH4通量整体低于淹水灌溉。孕穗期减氮下，除移栽后25 d 外，垄作灌溉稻田CH4通量总体低于淹水灌溉。垄作灌溉下，返青期减氮稻田CH4通量整体低于常规施氮。

图4 垄作灌溉和不同时期减施氮肥下稻田CH4 通量的变化情况Fig.4 Changes of CH4 flux in paddy field under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

稻田CH4的排放主要集中在返青期与分蘖期，在分蘖期达到排放高峰，于拔节孕穗期降低，在抽穗期短暂升高后下降(表1)。灌溉模式、施氮处理和两者的交互作用对稻田CH4的排放有显著影响，在分蘖前期、分蘖后期、抽穗期和成熟期，各处理稻田CH4累积排放量差异显著。返青期减氮、常规施氮和孕穗期减氮下垄灌80 和垄灌100 稻田全生育期CH4累积排放量较淹水灌溉分别低44.2% 和10.7%、20.9% 和30.7%、43.9% 和32.5%。垄灌80 下返青期减氮和孕穗期减氮稻田CH4累积排放量较常规施氮分别低35.5% 和18.8%，而垄灌100 下较常规施氮分别高17.9%和11.7%，淹水灌溉下返青期减氮较常规施氮低8.5%，而孕穗期减氮较常规施氮高15%。全部处理中，以垄灌80+返青期减氮处理稻田全生育期CH4累积排放量最低。

表1 垄作灌溉和不同时期减施氮肥下稻田CH4 累积排放量(E)1)Table 1 Cumulative CH4 emission (E) in paddy field under ridge irrigation and nitrogen reduction at different growth stages

2.4 稻田CH4 通量、土壤总有机酸和酶编码基因表达量之间的相关性

由表2 可知，稻田CH4通量与土壤MCR 编码基因mcrA表达量呈显著正相关关系(r=0.644、P＜0.01)，而与总有机酸含量呈显著负相关关系(r=-0.348、P＜0.01)。土壤总有机酸含量与土壤MCR 编码基因mcrA表达量呈显著负相关关系(r=-0.240、P＜0.05)，而与土壤MMO 编码基因sMMO表达量呈显著正相关关系(r=0.197、P＜0.05)。

表2 稻田CH4 通量与土壤总有机酸含量和酶编码基因表达量的相互关系1)Table 2 Correlation among CH4 flux from paddy field,total organic acid content and encoding gene expression level in paddy soil

3 讨论

3.1 垄作灌溉与减施氮肥对土壤总有机酸含量的影响

灌溉方式影响水稻根系有机酸的分泌，较淹水灌溉节水灌溉可促进根系分泌有机酸[26]。本研究发现，各处理在施分蘖肥后10 d 内总有机酸含量均升高，其中垄灌80+常规施氮处理在施肥后10 d 土壤总有机酸含量较施肥前高71.7%，淹水灌溉+常规施氮处理高28.8%。

施氮水平也影响土壤有机酸含量[27]，不施氮肥和施氮肥360 kg hm-2均会抑制水稻根系分泌有机酸，而适宜的施氮水平会提高土壤有机酸含量，有机酸能平衡植物内部的阴阳离子，硝态氮作为植物吸收无机氮的主要形态，进入细胞内部被转化为NH4+再参与氨基酸的生物合成，故植物每吸收1 个NO3-的同时会吸收2 个H+，植物为其内部酸碱平衡而释放出酸性物质[28]，提高土壤有机酸含量。本研究垄灌100 和淹水灌溉下返青期减氮土壤总有机酸含量较常规施氮高，表明返青期减氮较常规施氮促进植物根系有机酸的分泌，从而提高土壤有机酸含量。

3.2 垄作灌溉与减施氮肥对CH4 形成和转化相关酶编码基因表达量的影响

稻田CH4的排放与微生物种类与数量相关。本研究表明，返青期减氮下垄作灌溉分蘖期稻田土壤产CH4菌中MCR 编码基因mcrA表达量较淹水灌溉模式均低，而常规施氮下只有垄灌80 土壤mcrA表达量较淹水灌溉低。垄作灌溉土壤mcrA表达量较淹水灌溉低，可能原因是垄作灌溉水层较薄、氧气相对较充足，使厌氧的产CH4菌生长区域深度与产CH4菌活性降低，从而导致土壤mcrA表达量减少。返青期减氮下垄灌80 土壤mcrA表达量较垄灌100 低，说明垄面宽度100 cm 较垄面宽度80 cm 更利于产CH4菌生长，垄面宽度增加使其活性增强，土壤mcrA表达量增加[29]。本试验各处理土壤mcrA表达量总体呈现为分蘖期和拔节孕穗期增加的趋势，可能是因为氮肥的施入，施入氮肥短期内可以刺激土壤微生物活性，促进土壤有机质的分解，为产CH4菌提供良好的微生物环境，使得土壤mcrA表达量在分蘖期与拔节孕穗期增加，从而增加CH4排放。

本研究发现，在分蘖期，返青期减氮下垄作灌溉土壤sMMO表达量较淹水灌溉低，其他时期较淹水灌溉高，这是因为稻田CH4排放主要集中在分蘖期，因此分蘖期垄作灌溉土壤sMMO表达量低于淹水灌溉。但是整体上垄作灌溉土壤sMMO表达量较淹水灌溉高，可能原因是垄作灌溉土壤氧气相对较充足，好氧的CH4氧化菌活性增加，从而使稻田土壤sMMO表达量增加。

适宜施氮量有利于CH4氧化菌的生长繁殖，减少CH4的排放[30]。NH4+与CH4竞争CH4氧化菌中MMO 的相同活性结合位点，适宜的NH4+可以使CH4与MMO 结合量变少。本试验垄灌80 下，除移栽后20 d，返青期减氮土壤sMMO 表达量均较常规施氮高，可能原因是垄灌80 下，返青期减氮处理的施氮量较常规施氮更有利于CH4氧化菌的生长，使其活性提高和CH4氧化增强，减少CH4排放。

3.3 垄作灌溉与减施氮肥对稻田CH4 排放的影响

垄作灌溉通过改变不同时期稻田土壤水分状况，从而改变稻田CH4的排放[31]。本研究表明，分蘖期CH4排放量整体偏高，可能是因为分蘖期处于根系发育阶段，能产生更多的根系分泌物，分解转化为乙酸、H2和CO2等，为CH4的产生提供较多的基质。分蘖后期到孕穗期进行了晒田，使得土壤氧气充足，产CH4菌活性降低，从孕穗期到乳熟期产CH4菌活性处于恢复状态。成熟期垄作灌溉的水分管理处于波动状态，土壤通气性强，产CH4菌活性降低，致使稻田CH4排放降低[32]。Bodelier 等[10]认为，植物可以通过吸收与氮肥相关的亚硝酸盐毒性或盐使CH4氧化作用减弱，因而施用氮肥量与CH4排放量显著正相关。本试验垄灌100 下的减氮处理稻田CH4排放通量没有降低，可能是因为垄灌80 模式的垄宽较垄灌100 模式窄，垄沟内的水分能够很好地浸润到整个垄上，使得垄灌80 模式土壤水分含量较垄灌100 模式高，垄灌100 模式相对垄灌80 与淹水灌溉田间水分含量低，对亚硝酸盐毒性或盐的吸收缺失，使NH4+对CH4氧化产生了抑制作用，降低CH4氧化菌活性，导致施用氮肥量与CH4通量相关性不显著。

氮肥的施用可以同时影响产CH4菌和CH4氧化菌的活性，而产CH4菌和CH4氧化菌活性孰强孰弱决定CH4的排放情况。总体来说，在相同灌溉方式下，返青期减氮稻田CH4通量较常规施氮低，而孕穗期减氮无明显效应，可能因为稻田CH4排放主要集中在分蘖期前后，返青期减氮处理的低氮水平抑制了产CH4菌的生长环境，导致返青期减氮稻田CH4通量较常规施氮降低，孕穗期减氮相对于返青期减氮影响较小[9]。本研究的前期工作发现，与淹水灌溉相比，垄灌80 模式稻田CH4排放量减少45.6%～70.3%，晚稻产量增加17.6%[6]。本试验在垄灌80 模式基础下，继续探索减施氮肥后稻田CH4累积排放量，发现垄灌80 下返青期减氮稻田CH4累积排放量较常规施氮低35.5%。且水氮管理结合下，全生育期稻田CH4累积排放量以垄灌80+返青期减氮处理最低。本试验未测产，由前期研究可知，垄灌80 模式增产，但垄灌80 与减施氮肥结合的水氮管理稻田产量是否增加或保持不变尚不明确，是本试验不足之处，后续将进一步探究垄作灌溉与减施氮肥结合的水氮管理对产量的影响，在不减产基础上寻求合理的稻田CH4减排模式。

3.4 稻田CH4 通量与土壤总有机酸含量和酶编码基因表达量的关系

通过相关性分析，本研究发现稻田CH4通量与土壤MCR 酶编码基因mcrA表达量极显著正相关，而土壤MMO 酶编码基因sMMO表达量与CH4通量相关性不显著，但与土壤总有机酸含量显著相关，而土壤总有机酸含量与MMO 酶编码基因sMMO表达量极显著负相关。表明MMO 酶编码基因sMMO表达量虽然不直接影响稻田CH4排放，但通过土壤总有机酸间接影响稻田CH4通量。可能是因为高氮抑制MMO 酶编码基因sMMO的表达量[33]，且抑制植物根系分泌有机酸[27]，抑制CH4氧化菌的活性，增加稻田CH4排放。

与连续淹水相比，间歇灌溉使乙酸产CH4途径的相对贡献率降低了8%～10%；最后H2/CO2还原途径相对贡献率再次增大；在25 和35 ℃时，CH4通过乙酸盐和H2/CO2还原2 种途径产生，温度升高至45 ℃时，产CH4菌仅通过H2/CO2还原途径产生CH4[34-36]。本研究表明，稻田CH4与土壤乙酸含量相关性不显著，这可能是因为垄作灌溉和不同时期减施氮肥下稻田CH4的产生不是通过乙酸裂解途径，而是H2/CO2还原途径；且所种植的晚稻直到9 月下旬，都处于相对较高的温度，也可能是该阶段产CH4菌主要通过H2/CO2还原途径产生CH4的原因。

4 结论

本试验相同施氮处理下，垄作灌溉稻田CH4排放较淹水灌溉显著降低，相同灌水模式下，返青期减氮稻田CH4排放较常规施氮显著降低。水氮管理结合下，稻田全生育期CH4累积排放量以垄宽80 cm 的垄作灌溉+返青期减施氮肥25.0 kg·hm-2处理最低，是本试验稻田土壤CH4减排的最合理水氮管理模式。返青期减氮土壤有机酸含量和sMMO表达量较常规施氮高。返青期减氮下，垄宽80 和100 cm 的垄作灌溉土壤mcrA表达量较常规灌溉低。稻田CH4通量受到土壤总有机酸含量和mcrA表达量的影响，且土壤sMMO 表达量会间接影响稻田CH4通量。