基于网络药理学和分子对接技术探讨半夏治疗糖尿病胃轻瘫的作用机制※

黄嘉家,肖雅松,叶金鑫,林 青,张荣华

(1.暨南大学,广东 广州510632;2.广东省中医药信息化重点实验室,广东 广州 510632)

糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis,DGP)是一组以胃排空延迟和上消化道症状为特征的综合征,为糖尿病主要并发症之一,临床表现为腹胀、恶心、呕吐等。目前糖尿病患者中DGP发病率已高达60%,严重影响患者的生活质量[1-3]。中医认为,DGP属“消渴”“痞满”“呕吐”范畴,病机多为脾胃虚弱、气机阻滞、痰湿水饮停聚,故多治以健脾和胃、行气化痰[4]。理气化痰类中药具有理气止呕、化痰消痞等功效,为治疗DGP的重要切入点。

半夏为天南星科植物半夏[PinelliaeRhizoma(Thunb.)Breit.]的干燥块茎,具有燥湿化痰、散结消痞、降逆止呕之效。半夏是半夏泻心汤、小半夏汤与半夏厚朴汤等诸多治疗DGP常用方剂的君药,众多学者采用系统聚类分析、关联规则、因子分析等方法研究古今临床治疗DGP的用药规律,发现半夏为临床治疗DGP应用较多的药物之一[5-8]。可见,半夏是中药治疗DGP的重要组成药物。现代研究显示,半夏具有止呕、抗溃疡、抗炎、调节胃肠功能等作用,既可通过中枢性抑制和激活迷走神经以止呕,还可通过抑制胃酸分泌和胃蛋白酶活性以减缓胃肠道反应[9-12]。然而,半夏治疗DGP的具体作用机制尚未深入探讨,有待进一步研究。网络药理学是预测、评估药物治疗疾病作用机制的有效方法,分子对接技术可进一步为药物靶点研究提供技术支持。本研究采用网络药理学和分子对接技术探讨半夏治疗DGP的物质基础及网络作用机制。

1 资料与方法

1.1 半夏活性成分的筛选与靶点预测 在中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中检索半夏的化学成分,以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为参数,筛选半夏的活性成分及其对应的靶点基因;利用PubChem数据库下载活性成分SDF格式文件,输入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中预测其靶点基因。整合TCMSP与SwissTargetPrediction预测的靶点基因,去重,获得半夏活性成分的作用靶点。

1.2 DGP相关靶点的筛选 在Genecards(https://www.genecards.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)及NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中分别以“Diabetic gastroparesis”或“Delayed gastric emptying”为关键词,筛选DPG相关靶点基因。

1.3 半夏活性成分-DGP交集靶点网络的构建 利用Venny 2.1在线软件获取半夏活性成分靶点与DGP相关靶点的交集靶点;借助Cytoscape 3.8.0软件构建“半夏活性成分-交集靶点”网络图。计算各节点连接数,评估网络中各节点的相互联系程度。

1.4 PPI网络的构建与拓扑分析 基于Cytoscape 3.8.0的BisoGenet 3.0插件中的DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、NINT、BIND数据库,定义参数为“Homosapiens”,对1.3获得的交集靶点进行蛋白互作(PPI)网络构建。借助Cytoscape 3.8.0的CytoNCA插件,对PPI网络进行拓扑分析,以节点的度中心性(DC)、介数中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、局部平均中心性(LAC)、网络中心性(NC)6个参数作为参考标准,筛选DC值排名前50的靶点,再依据DC、BC、CC、EC、NC、LAC参数筛选PPI网络的核心靶点。

1.5 GO和KEGG富集分析 将1.4得到的核心靶点输入Cytoscape 3.8.0中的ClueGO插件中,进行基因本体(GO)功能富集和京都基因组与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析(P<0.05,FDR<0.05),构建“核心靶点-KEGG信号通路”网络图。

1.6 分子对接 选取高DC值的核心靶点和活性成分,分别作为对接蛋白和对接配体,同时以临床上常用于治疗DGP的药物西沙必利作为阳性对照配体。其中,对接蛋白3D结构从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中下载,去除原配体;活性成分和阳性对照配体的mol2文件从ZINC数据库(http://zinc15.docking.org/)下载,利用Autodock 4.2软件进行分子对接,并用PyMOL 2.4软件将对接结果可视化。

2 结果

2.1 半夏有效成分与DGP相关靶点筛选 从TCMSP数据库获得半夏的13个活性成分,见表1。整合TCMSP与SwissTargetPrediction获得半夏活性成分靶点基因共461个。从Genecards、TTD、NCBI数据库分别得到与DGP相关靶点429、5、19个,合并与删除重复项后得到388个。将半夏活性成分靶点与DGP相关靶点进行交集,获得68个交集靶点,见图1。

图1 半夏-糖尿病胃轻瘫潜在靶点韦恩图

表1 半夏活性成分

2.2 “半夏活性成分-交集靶点”相互作用网络分析 “半夏活性成分-交集靶点”网络图如图2所示,相互作用关系包括81个节点和165条边。13个活性成分的DC值中位数为11,预示半夏多数活性成分可作用于多个DGP相关靶点。其中DC值较高的活性成分为MOL002714(黄芩素)、MOL006957[环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)]和MOL000358(β-谷甾醇)。

图2 “半夏活性成分-交集靶点”网络图

2.3 PPI网络的构建与拓扑分析 交集靶点的PPI网络构建图如图3A所示,PPI网络包含4 711个节点和115 417条边。利用Cytoscape 3.8.0的插件CytoNCA,对PPI网络各节点的拓扑参数DC、BC、CC、EC、NC、LAC值进行计算,筛选获得327个节点构成的核心靶点网络(图3B、3C)(图3见本期第125页)。

注：A为交集靶点的蛋白质相互作用(PPI)网络图;B为经度中心性(DC)>7初步筛选后的PPI网络图;C为核心靶点网络图,其中红色部分为半夏与DGP的交集靶点。

2.4 GO和KEGG富集结果 对PPI核心靶点进行GO功能富集分析共得到2 324个条目,其中细胞组分(CC)、分子功能(MF)、生物途径(BP)分别有239、224、1 861个条目。如图4所示,核心靶点的CC主要与黏着斑、细胞-基质黏附连接、细胞-基质连接等作用相关,MF主要与泛素蛋白连接酶结合、泛素-类蛋白连接酶结合、细胞黏附分子结合等作用相关,BP主要有mRNA分解代谢过程、RNA分解代谢过程、细胞周期调控等。核心靶点的KEGG通路富集分析得到148条信号通路,包括细胞周期、甲状腺激素信号通路和低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路等,见图4。KEGG通路富集分析结果中排名前20条通路的核心靶点有157个,其中12个是半夏活性成分靶点和DGP疾病靶点的交集靶点,根据其在KEGG关系网络图中的DC值排序为丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、蛋白激酶1(AKT1)、JUN原癌基因(JUN)、信号转导及转录激活蛋白(STAT3)、丝裂原活化酶2(CDK2)、非受体酪氨酸激酶(SRC)、人表皮生长因子受体(EGFR)、缺氧诱导因子-1A(HIF1A)、雌激素受体(AR)、环状素受体1(ESR1)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶6(AURKA),见图5。

注：图A、B、C分别为基因本体(GO)功能富集分析的生物途径(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)结果;图D为京都基因组与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析结果。

注：三角形代表京都基因组与基因组百科全书(KEGG)通路富集信号通路;方形代表核心靶点。

2.5 分子对接结果 选择MAPK1、AKT1为对接蛋白,黄芩素和环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)为对接配体,另外选择西沙必利为阳性对照配体。对接蛋白与对接配体的结合能越低,代表形成的分子对接结构结合活性越强。分子对接结果模式如图6所示,两个活性成分和阳性对照配体与核心蛋白MAPK1、AKT1均有良好的亲和力,除环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)与AKT1外,其他结合模式均能通过氢键结合。

注：图A、B、C分别代表黄芩素、环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)、西沙必利与丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的对接情况;图D、E、F分别代表黄芩素、环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)、西沙必利与蛋白激酶1(AKT1)的对接情况。

黄芩素和环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)与MAPK1的结合能均低于阳性对照配体西沙必利,其中环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)与MAPK1结合能更低,提示环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)与MAPK1有更强的结合活性;黄芩素和环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)与AKT1的结合能均低于阳性对照配体西沙必利,其中黄芩素和AKT1的结合能更低,提示黄芩素与AKT1有更强的结合活性。分子对接结合能见表2。

表2 半夏关键有效成分和核心靶点蛋白的分子对接结合能(kcal/mol)

3 讨论

DGP症见呕吐、腹胀、嗳气、恶心等,属中医“消渴”“痞满”“呕吐”等范畴,病机为消渴日久,气血亏虚,使脾胃运化无力,气机升降失调,以致胃气上逆,气滞痰阻。临床治疗DGP多采用调和脾胃、消痞化痰、健脾益气之和、消、补法[6]。半夏具有化痰止呕、散结消痞之功,兼具和、消、补之效,为临床治疗DGP的常用中药[5-6]。本研究运用网络药理学与分子对接技术从多成分、多靶点、多通路的网络角度探究半夏治疗DGP的作用机制。

本研究共筛选出与DGP相关的活性成分13个,其中黄芩素、β-谷甾醇、环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)的靶点连接度较高,在半夏治疗DGP中发挥主要作用。研究发现,黄芩素对糖尿病有一定治疗作用。LI Y K等[13]应用黄芩素干预链脲霉素诱导的胰岛素缺乏糖尿病大鼠,发现黄芩素能降低糖尿病大鼠空腹血糖、随机血糖和血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)含量;黄芩素还可通过降低皮质中脂氧合酶的表达,影响p38 MAPK及其磷酸化酶的合成,抑制p38 MAPK介导的细胞凋亡而发挥保护神经作用,减少部分糖尿病并发症的发生。黄芩素还具有类固醇激素作用,可通过介导α2-肾上腺素受体、前列腺素和三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾通道,减少Cajal间质细胞的炎性反应,激活Cajal间质细胞的抗氧化过程,增加黏液分泌,发挥胃保护作用[14-15]。环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)为半夏特有成分,是一种哌嗪二酮类化合物,是治疗糖尿病胃轻瘫的潜在化合物,然其相关研究甚少,值得进一步探究。β-谷甾醇可通过提高血清中一氧化氮含量,提高受损胃黏膜的修复能力;通过降低内皮素1水平,发挥抗胃溃疡作用[16-17]。因此,半夏发挥药效的物质基础与黄芩素、β-谷甾醇等有效成分密切相关。

KEGG通路富集分析结果显示,MAPK1、AKT1及JUN等是半夏治疗DGP的重要靶点。MAPK1是一种线粒体活化蛋白激酶,是胰岛素信号通路的关键因子之一,与葡萄糖的转运和代谢密切相关,在胰岛素抵抗中发挥重要作用[18-19]。MAPK是成纤维细胞生长因子21(FGF21)下游的关键激酶,可通过磷酸化靶蛋白抑制肝脏对糖的输出,增加饱腹感并抑制糖分摄入,起控制血糖的作用[20-21]。研究显示,p38/MAPK的激活可促进雌激素受体转移至细胞核,并与雌激素反应元件结合,维持机体胃排空功能[22]。AKT参与细胞的凋亡、周期进展及葡萄糖和脂质代谢等过程,与DGP的发生密切相关。研究显示,AKT可通过抑制叉头框蛋白O1(FoxO1)的表达,刺激己糖激酶将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸钠盐,从而降低血糖水平[23]。AKT与p-AKT蛋白含量的高低影响胃排空率和小肠推进率,与胃肠激素的调节、胃肠动力密切相关[24-25]。研究显示,AKT的磷酸化可降低链脲霉素诱导的糖尿病小鼠胃Cajal间质细胞的丢失,抑制Bax、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9的表达及胃Cajal间质细胞的凋亡[26-27]。因此,MAPK1、AKT1等靶点与DGP密切相关,为半夏发挥抗DGP的重要靶点。

KEGG通路富集分析结果亦显示,甲状腺激素信号通路和HIF-1信号通路可能为半夏治疗DGP的关键通路。研究发现,甲状腺激素可激活胰岛素信号通路的上游因子胰岛素受体底物-1(IRS-1),降低2型糖尿病模型小鼠血糖水平,提高糖尿病小鼠胰岛素敏感性和血浆胰岛素水平[28]。此外,甲状腺激素可通过直接作用于胃肠道平滑肌及儿茶酚胺刺激胃肠道运动[29]。钟凤等[30]研究发现,甲状腺内有胃动素免疫阳性细胞,胃动素与降钙素共存并表达于甲状腺C细胞。HIF可通过控制糖酵解限速步骤诱导细胞糖酵解[31]。研究显示,HIF-1α在DGP大鼠胃黏膜中表达增加,可提高1型糖尿病大鼠胃黏膜血管的通透性,是调控DGP胃排空延迟的关键因子[32]。因此,半夏可能通过甲状腺激素和HIF-1等信号通路,调控血糖、促进胃肠道运动、逆转胃排空延迟、增加胃黏膜血管的通透性等发挥抗DGP的作用。

本研究初步推测半夏主要通过黄芩素、β-谷甾醇、环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)等活性成分发挥调控血糖、促进胃肠道运动、逆转胃排空延迟等作用,从而达到治疗DGP的目的。分子对接结果提示,黄芩素、环(L-酪氨酰-L-苯丙氨酰)可与MAPK1和AKT1结合,调控HIF-1信号通路和甲状腺激素信号通路,这可能为半夏防治DGP的重要机制,值得进一步探索。

中药的药效物质基础是一个由多种成分构成的药效组分群,可通过网络交叉产生整体的药效作用,与以整体性、系统性为研究特色的网络药理学不谋而合。在广泛的中药网络药理学研究中,中药活性成分主要按OB≥30%、DL≥0.18为标准进行筛选,并验证了许多具有药效作用的成分及其相关作用机制。然而,该筛选方法也存在弊端,如不同性状的中药在机体不同的生理病理状态下,吸收、分布、代谢及排泄的过程是不完全相同的。因此,基于血清代谢组学等方法研究中药在患者或疾病模型动物中的有效成分及代谢产物,并基于这些吸收、代谢成分开展网络药理学的研究更符合药理学研究。半夏的主要成分包括生物碱类、有机酸类、蛋白质类、核苷类、氨基酸类、挥发油类、甾醇类及蛋白质类等,但其相关特异性药效成分在体内的代谢过程,以及相关作用机制研究甚少,以单味中药治疗DGP的研究尚未见报道[33]。半夏是临床防治DGP的重要中药,但其作用机制仍未具体研究。因此,本研究仍基于广泛应用的活性成分筛选方法,基于现有的半夏化学成分进行初步筛选,以期初步探索半夏治疗DGP的潜在作用机制,为进一步的研究提供参考。