肿瘤细胞对雷公藤甲素递送系统的敏感性考察

王风杰，金玲玲，曹瑞珍，尹美珍

（内蒙古民族大学 医学院，内蒙古 通辽 028043）

雷公藤甲素（Triptolide，TPL）是中药雷公藤的主要成分，对肺癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞具有多途径、多靶点的抑制增殖和杀灭作用［1-6］以及抗耐药性作用［4］，被研究者［7］认为优于传统化疗药物顺铂、丝裂霉素和紫杉醇。然而，TPL在临床应用中由于其严重的全身毒性受到了限制。纳米药物载体依赖EPR效应可富集于肿瘤部位，表面引入肿瘤细胞膜过度表达某种受体的配体，通过受体介导作用可提高肿瘤细胞对药物载体的内吞效率，将药物递送到肿瘤细胞内，从而降低药物由于无选择性而导致的全身毒性。

普朗尼克是一种两亲性的三嵌段聚合物，在水溶液中可自组装成具有“核-壳”结构的纳米胶束，将疏水性药物包载于内核中。由于多种肿瘤细胞膜表面过度表达叶酸受体［8-10］，因而叶酸作为配体被广泛应用于靶向药物载体的研究。普朗尼克胶束亲水链外壳上的羟基，很容易耦连小分子叶酸。研究发现2种不同普朗尼克的亲水和疏水嵌段之间相互作用，可增加载药胶束的稳定性，不受血液稀释的影响［11］。普朗尼克F-127分别与P105、P123以及L61制备的3种双普朗尼克载药胶束均能显示出较强的抗肿瘤作用［12-14］。普朗尼克F-127和F-68常被用作药用辅料，不仅生物相容性好，而且经济易得，因此，笔者通过本实验以F-127和F-68为载体材料，制备装载TPL的叶酸修饰的双普朗尼克载药胶束，旨在考察肿瘤细胞对该递药系统的敏感性，为TPL靶向递送的抗癌研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物、材料与试剂

普朗尼克F-127、F-68（BASF，Ludwigshsfen，Germany），雷公藤甲素（纯度98.5%，Aladdin），叶酸、N，N’-羰基二咪唑（Aladdin），透析袋（Spectra，Millipore，MWCO 1000），胎牛血清（四季青），RPMI-1640培养液（Hyclone）。

1.2 雷公藤甲素递送系统的制备

1.2.1 FA-F-127缀合物的制备

取适量叶酸，用DMSO溶解后，加入等摩尔的N，N’-羰基二咪唑，在暗处搅拌24 h，再加入1/4量的普朗尼克F-127，暗处反应24 h。反应混合物装入透析袋，用去离子水透析72 h，期间每隔3～6 h更换1次去离子水，再经冷冻干燥后得到叶酸修饰的普朗尼克F-127缀合物（FA-F-127）。

1.2.2 FA-F-127/F-68-TPL的制备

将普朗尼克F-68和FA-F-127各100 mg以及7 mg的TPL，用适量无水乙醇充分溶解，室温下以氮气流将溶剂蒸干，真空干燥过夜后得到透明的薄膜。将薄膜用一定量的去离子水，在50 ℃条件下，300 rpm·min-1搅拌30 min进行水化，静置至室温后，用0.22 μm无菌滤膜过滤，得到FA-F-127/F-68-TPL溶胶溶液，4 ℃保存备用。F-127/F-68-TPL溶胶溶液中TPL的含量采用RP-HPLC法测定。以下实验所提及FA-F-127/F-68-TPL的浓度实则为含TPL的浓度。

1.2.3 FA-F-127/F-68的制备

不加雷公藤甲素，与1.2.2同法制备FA-F-127/F-68（空载体）溶胶溶液。

1.3 细胞及细胞培养

HepG2细胞（人肝癌细胞系）、MCF-7细胞（人乳腺癌细胞系）、769-P细胞（人肾癌细胞系），均购自武汉大学的中国典型培养物保藏中心；SK-MES-1 细胞（人肺鳞癌细胞系），购自上海科学院细胞保藏中心。4种细胞均置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液常规培养。

1.4 倒置显微镜观察

将对数生长期的HepG2、SK-MES-1、MCF-7和769-P 4种细胞分别接种于6孔培养板。待24 h细胞贴壁后，将每种细胞分为7 组。3 个浓度的FA-F-127/F-68-TPL 组，分别更换含25、50、100 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL 的完全培养液；3 个浓度的FA-F-127/F-68（空载体）组，分别更换与FA-F-127/F-68-TPL组含等浓度载体的完全培养液；1个对照组，更换新鲜的完全培养液。将细胞置于细胞培养箱继续培养，每日倒置显微镜下观察细胞的生长状况并拍照。

1.5 生长抑制率和半数抑制浓度测定

将对数生长期的HepG2、SK-MES-1、MCF-7和769-P细胞分别以每毫升1×104密度接种于96孔培养板。待细胞贴壁后，将每种细胞分为4个浓度（25、50、100、200 ng·mL-1）的FA-F-127/F-68-TPL组，并设空载体组以及1个对照组，加药方法同上。将细胞置于细胞培养箱继续培养24 h后，每孔加入MTT与细胞共孵育4 h后，弃掉每孔液体，加入DMSO 150 μL，震荡15 min，多功能酶标仪（SpectraMax Paradigm，Molecular Devices，USA）检测各孔在570 nm处的吸光度（OD）值。各重复孔的OD值取平均值，计算细胞的生长抑制率，并利用在线拟合工具获得拟合函数，计算半数抑制浓度（IC50）。

1.6 肿瘤细胞的活性测定

将对数生长期的HepG2、SK-MES-1以及MCF-7细胞分别以每毫升1×104密度接种于96孔培养板。待细胞贴壁后，将每种细胞分为FA-F-127/F-68-TPL组、裸药TPL组和对照组。FA-F-127/F-68-TPL组和TPL组分别更换含FA-F-127/F-68-TPL和TPL浓度为50 ng·mL-1的培养液，对照组更换新鲜的完全培养液。细胞置于培养箱中继续培养。分别于药物作用细胞24、48、72 h 时，检测各孔的OD 值，方法同上。各重复孔的OD值取平均值，采用统计学t检验分析组间差异性。

2 结果

2.1 FA-F-127/F-68-TPL对肿瘤细胞形态及生长状态的影响

在FA-F-127/F-68-TPL作用细胞24 h或48 h时，光镜下可见对照组与空载体组的HepG2、SK-MES-1、MCF-7以及769-P细胞均生长旺盛，没有明显差异，说明空载体对4种细胞均无明显影响。而不同浓度的FA-F-127/F-68-TPL对4种细胞的生长状态与对照组比较有不同程度的影响。

2.1.1 FA-F-127/F-68-TPL对肝癌细胞的影响

图1 显示FA-F-127/F-68-TPL 作用HepG2 细胞的光镜观察结果。作用HepG2 细胞24 h，浓度为25 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL 使HepG2 细胞的数量明显减少，可见FA-F-127/F-68-TPL 能抑制细胞增殖；当浓度为50 ng·mL-1以上时，FA-F-127/F-68-TPL导致大量的HepG2细胞死亡而漂浮于培养液中。作用HepG2细胞48 h，25 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL也可使大量HepG2细胞死亡。

图1 FA-F-127/F-68-TPL处理HepG2细胞24 h和48 h的光镜照片Fig.1 Light microscope photos of HepG2 cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h and 48 h

2.1.2 FA-F-127/F-68-TPL 对肺癌细胞的影响

图2 显示FA-F-127/F-68-TPL 作用SK-MES-1 细胞的光镜观察结果。FA-F-127/F-68-TPL 作用SK-MES-1 细胞24 h，25 ng·mL-1组的SK-MES-1 细胞增殖减慢，50 ng·mL-1和100 ng·mL-1组的SK-MES-1 细胞大量死亡；作用SK-MES-1 细胞48 h 时，FA-F-127/F-68-TPL各浓度组均可见大量漂浮的死亡细胞。

图2 FA-F-127/F-68-TPL处理SK-MES-1细胞24 h和48 h的光镜照片Fig.2 Light microscope photos of SK-MES-1 cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h and 48 h

2.1.3 FA-F-127/F-68-TPL对乳腺癌细胞的影响

图3显示FA-F-127/F-68-TPL作用MCF-7细胞的光镜观察结果。作用MCF-7细胞24 h，与对照组比较，不同浓度FA-F-127/F-68-TPL 使MCF-7 细胞增殖减弱，形态略变圆。作用细胞48 h，25 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL使MCF-7细胞形态明显变圆，当浓度为50 ng·mL-1以上时使MCF-7细胞大量死亡。

图3 FA-F-127/F-68-TPL处理MCF-7细胞24 h和48 h的光镜照片Fig.3 Light microscope photos of MCF-7 cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h and 48 h

2.1.4 FA-F-127/F-68-TPL对肾癌细胞的影响

图4 显示FA-F-127/F-68-TPL 作用769-P 细胞的光镜观察结果。FA-F-127/F-68-TPL 作用后的769-P细胞明显的变化是细胞逐渐收缩，随细胞收缩加重，769-P细胞通过伸出突起相互连接，变为相互堆积。作用细胞24 h或48 h，FA-F-127/F-68-TPL导致细胞收缩的程度与其浓度呈正相关；同一浓度的FA-F-127/F-68-TPL导致细胞收缩的程度与作用时间呈正相关。

图4 FA-F-127/F-68-TPL处理769-P细胞24 h和48 h的光镜照片Fig.4 Light microscope photos of 769-P cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h and 48 h

总之，通过光镜观察可知，FA-F-127/F-68-TPL 能使HepG2、SK-MES-1、MCF-7 和769-P 细胞增殖减慢，形态改变，甚至诱导细胞死亡。由此可认为，FA-F-127/F-68-TPL 对4 种细胞都有一定的毒性作用。根据FA-F-127/F-68-TPL诱导肿瘤细胞死亡的作用时间和使用剂量，评价4种肿瘤细胞的敏感性。由于50 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL 作用肿瘤细胞24 h 时，能诱导大量的HepG2 细胞和SK-MES-1细胞死亡，而作用肿瘤细胞48 h时，才能诱导MCF-7细胞死亡，但仍不能诱导769-P细胞死亡。由此可初步推测，HepG2和SK-MES-1细胞对FA-F-127/F-68-TPL较为敏感，而769-P细胞的敏感性最差。

2.2 FA-F-127/F-68-TPL对肿瘤细胞的生长抑制率和IC50

作用HepG2、SK-MES-1、MCF-7和769-P细胞24 h后，不同浓度的空载体组与对照组的OD 值无统计学差异，说明在此浓度范围内空载体对肿瘤细胞没有影响。

生长抑制率大于30%以上被认为有抑制作用。由表1的生长抑制率可知，作用细胞24 h，50～200 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL对HepG2细胞和SK-MES-1细胞有抑制作用。表2数据显示，FA-F-127/F-68-TPL对HepG2细胞的IC50低于对SK-MES-1细胞的IC50，100～200 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL对MCF-7细胞有抑制作用，而对769-P细胞无抑制作用。由此可见，4种肿瘤细胞对FA-F-127/F-68-TPL的敏感顺序应为HepG2细胞＞SK-MES-1细胞＞MCF-7细胞＞769-P细胞。

表1 FA-F-127/F-68-TPL作用肿瘤细胞24 h的生长抑制率Tab.1 Growth inhibition rate of tumor cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24 h

表2 FA-F-127/F-68-TPL对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50）Tab.2 Half inhibitory concentration（IC50）of FA-F-127/F-68-TPL on tumor cells

2.3 FA-F-127/F-68-TPL与TPL的细胞毒性比较

测定细胞的吸光度值（OD值），可判断细胞的活性。OD值越小，细胞活性越弱，同时反映药物的毒性越大。图5显示，50 ng·mL-1的FA-F-127/F-68-TPL作用HepG2、SK-MES-1和MCF-7细胞24 h，对于各种细胞，FA-F-127/F-68-TPL 组的OD 值与对照组比较有显著性差异（P＜0.01），而TPL 组的OD 值与对照组比较则无统计学差异（P＞0.05）。说明这3种肿瘤细胞对浓度为50 ng·mL-1的TPL不敏感，而对FAF-127/F-68-TPL则敏感。

图5 FA-F-127/F-68-TPL作用各种肿瘤细胞24 h的各组细胞OD值Fig.5 OD values of various tumor cells in each group after FA-F-127/F-68-TPL treating for 24 h

作用细胞24～72 h，HepG2、SK-MES-1和MCF-7细胞的OD 值变化曲线（图6（a）、图6（b）和图6（c））均显示：FA-F-127/F-68-TPL组的OD值变化曲线呈下降趋势，而TPL组的OD值变化曲线接近对照组的OD值变化曲线，呈上升趋势。说明FA-F-127/F-68-TPL对3种肿瘤细胞的毒性比同浓度的TPL的细胞毒性大。在作用细胞24、48、72 h的时间点，3种细胞的FA-F-127/F-68-TPL组的OD值均小于对照组的OD 值（P＜0.01），同时，也均小于TPL 组的OD 值（P＜0.01）。说明FA-F-127/F-68-TPL 和TPL 对肿瘤细胞的毒性有显著性差异。

图6 FA-F-127/F-68-TPL作用肿瘤细胞24～72 h的OD值变化曲线Fig.6 Change curves of OD value of tumor cells treated with FA-F-127/F-68-TPL for 24～72 h

这些结果说明，FA-F-127/F-68-TPL比裸药的毒性大，从而提高肿瘤细胞的敏感性。

3 讨论

倒置显微镜是观察培养细胞最常用的工具之一，其操作技术简单，能够方便、快速地对培养细胞进行连续的动态观察。细胞形态能直观地反映细胞的生存状态，细胞形态的改变是判断细胞生存状态好坏的最直接证据之一，可直观、定性地考察抗癌药物的疗效。本实验倒置显微镜观察了FA-F-127/F-68-TPL对培养的4种肿瘤细胞生存状态的影响，根据FA-F-127/F-68-TPL的剂量和作用时间、肿瘤细胞形态的改变程度、诱导细胞死亡，定性评价4种肿瘤细胞对FA-F-127/F-68-TPL的敏感性。

肿瘤细胞的一个重要生物学特征就是细胞的持续分裂和不断增殖，因此，对肿瘤细胞的增殖抑制是评价药物疗效的一个重要指标。MTT比色法常用于体外检测抗癌药物活性，间接判断细胞的存活率和增殖程度。该方法灵敏度高，重复性好，操作简便、经济、快速，实验结果比较可靠，一直被广泛用于抗肿瘤药物敏感性的测定和筛选实验。本实验通过MTT试验评价4种肿瘤细胞对FA-F-127/F-68-TPL的敏感性，与倒置显微镜观察结果基本相符。因此，可推测4种肿瘤细胞对FA-F-127/F-68-TPL的敏感顺序为HepG2细胞＞SK-MES-1细胞＞MCF-7细胞＞769-P细胞，且FA-F-127/F-68-TPL提高了肿瘤细胞的敏感性。