蓖麻叶总黄酮纯化工艺优化及抗氧化研究

穆莎茉莉，袁晓霞，李国瑞，包英才

（1.内蒙古民族大学生命科学与食品学院，内蒙古通辽 028043；2.内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室，内蒙古 通辽 028000；4.内蒙古自治区蓖麻产业系统创新培育中心，内蒙古 通辽 028000）

蓖麻为大戟科植物，植株高大［1］，枝叶繁茂，适应环境能力强，南北方地区均有种植，资源丰富、经济价值高。蓖麻叶中含有多种活性成分，如黄酮类、有机酸类、香豆素类、生物碱类等［2］。研究表明，黄酮化合物对·OH、、DPPH·、ABTS+·有良好的清除能力，具有一定的抗氧化能力［3-5］、抗疲劳作用［6］和抑菌能力［7］。天然植物中的黄酮化合物含量较低，提取后含有较多杂质，需要进一步分离纯化。其分离纯化的方法较多，如离心分离法、溶剂气浮分离技术、重结晶法、柱层析色谱法、双水相萃取法和膜分离法等［8-9］，其中，大孔树脂柱层析色谱法因大孔树脂种类较多、可再生、选择性好、反应条件温和而应用最为广泛［10］。笔者对从蓖麻叶中提取的总黄酮进行纯化及抗氧化活性研究，旨在通过大孔树脂的纯化作用提高蓖麻总黄酮提取物纯度，为开展后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

蓖麻鲜叶采自内蒙古民族大学农业科技园区作物品种园。

1.1.2 试验试剂

试验试剂为芦丁标准品（纯度≥98%）；纤维素酶5万U·g-1（江苏瑞阳生物科技有限公司）；1，1-二苯基-2-苦基肼（纯度≥98%，合肥巴斯夫生物科技有限公司）；抗坏血酸、氢氧化钠、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、盐酸（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）；AB-8、NKA-9、HPD100、S-8、ADS-17、DM130型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料有限公司）。

1.1.3 试验仪器

N-4 紫外分光光度计（上海仪电物理光学仪器有限公司）；HH-4 恒温水浴锅（江苏常州荣华仪器制造有限公司）；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏仪表有限公司）；XO-SM超声波组合仪（南京先欧仪器制造有限公司）；A-O104分析天平（梅特勒托利多科技（中国）有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 蓖麻叶总黄酮粗提液的制备 取蓖麻叶清洗后烘干并粉碎，过60目筛，得到蓖麻叶粉。称取蓖麻叶粉50.0 g，采用酶法提取工艺稍加修改［11］，纤维素酶添加量0.5%、pH 为4.5、酶解温度50 ℃，酶解时间80 min，酶解完成灭活并抽滤，滤渣用60%乙醇，超声300 W条件下提取30 min 后抽滤，将2次滤液合并浓缩后用蒸馏水稀释，得到蓖麻叶黄酮粗提液。

1.2.2 大孔树脂的预处理

6 种型号的大孔树脂（AB-8、NKA-9、HPD100、S-8、ADS-17、DM130）采用陈素雯等［12］的方法处理备用。

1.2.3 大孔树脂的筛选

静态吸附和解吸：称取树脂各2.0 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，加入1.56 mg·mL-1蓖麻总黄酮溶液50 mL，置于恒温振荡器上（25 ℃，100 r·min-1），充分吸附24 h，过滤，测定滤液中蓖麻总黄酮浓度并计算大孔树脂对总黄酮的吸附率、吸附量。将吸附饱和的树脂用水冲洗后抽滤，置于100 mL 锥形瓶中加入70%乙醇50 mL，震荡24 h充分解吸，收集解吸液，测定总黄酮浓度。

吸附率=（C0-C1）/C0×100%；吸附量（mg·g-1）=（C0-C1）V0/M；解吸率=［C2V2/（C0-C1）V0］×100%；解吸量（mg·g-1）=C2V2/M。其中，C0为吸附前总黄酮浓度（mg·mL-1），V0为上样液体积（mL），C1为吸附后溶液中总黄酮浓度（mg·mL-1），C2为解吸后总黄酮浓度（mg·mL-1），V2为解吸液体积（mL），M为树脂质量（g）。

1.2.4 大孔树脂的动态吸附试验

准确称取15.0 g 优选后的树脂，湿法装柱，分别考察下面各因素对蓖麻叶中总黄酮的纯化作用的影响。

（1）上样流速及上样体积对吸附作用的影响：控制上样浓度为0.98 mg·mL-1，上样流速分别为1、2和3 BV·h-1，每10 mL收集1份流出液，当流出液中蓖麻总黄酮浓度为上样液浓度的10%时达到泄漏点，绘制泄露曲线。

（2）不同上样浓度对大孔树脂吸附作用的影响：以上样体积120 mL，上样流速2 BV·h-1，pH为4，质量浓度分别为0.20、0.59、0.98、1.37和1.76 mg·mL-1的总黄酮粗提液，考察上样浓度对纯化蓖麻黄酮的影响。

（3）pH对大孔树脂吸附作用的影响：以上样体积120 mL，上样流速2 BV·h-1，上样浓度0.98 mg·mL-1，调节上样溶液的pH至3、4、5、6和7，考察不同pH的上样液对树脂吸附率的影响。

（4）洗脱浓度对大孔树脂解吸作用的影响：以溶液体积120 mL，流速2 BV·h-1，总黄酮浓度0.98 mg·mL-1，调节pH 为4 进行上样，上样后以4 BV 蒸馏水洗脱后，控制洗脱液乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%和90%，考察乙醇洗脱浓度对解吸作用的影响。

（5）洗脱流速、洗脱液体积对大孔树脂的解吸作用的影响：饱和吸附后的树脂先用水洗去杂质，选择70%乙醇作为洗脱剂，控制洗脱流速分别为2、3和4 BV·h-1进行洗脱，每10 mL收集1份流出液，并测定流出液中的总黄酮浓度，绘制解吸曲线，考察洗脱流速、洗脱体积对解吸作用的影响。

1.2.5 验证试验

收集洗脱液并测定计算洗脱液中总黄酮含量，将洗脱液浓缩干燥称重，在最佳纯化条件下进行3次平行试验，计算总黄酮纯度［14］。

总黄酮纯度=M1/M0×100%，式中，M1为溶液中总黄酮质量（mg），M0为溶液浓缩干燥后的质量（mg）。

1.2.6 蓖麻总黄酮对DPPH自由基清除能力的测定

将VC与纯化后的蓖麻黄酮配制成不同浓度的待测液，分别取2 mL置于试管中，分别加入0.2 mmol·L-1DPPH乙醇溶液2 mL，混匀避光静置30 min后于517 nm处测定其吸光度（a1）；将上述操作中的DPPH换成无水乙醇，重复操作过程，得到吸光度（a2）；将2 mL DPPH和2 mL无水乙醇反应作为空白对照，517 nm处测定其吸光度（a0），DPPH清除率［14］按下式计算：Y=［1-（a1-a2）/a0］×100%。

1.3 蓖麻叶总黄酮的测定

参考林春梅［15］的方法绘制芦丁标准曲线，回归方程为：Y=0.220 0X-0.211 4（R2=0.999 6），各浓度溶液按照标准曲线制作相同方法测出吸光度，根据回归方程计算总黄酮质量浓度。

1.4 数据统计分析

采用Micorosoft Excel 2010进行图表制作及数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同大孔树脂吸附解吸性能比较

表1为不同大孔树脂解吸性能比较。由表1可知，对蓖麻总黄酮吸附能力最强的是树脂S-8，吸附率超过了90%，但其解吸率最低，因此不适用于本试验。通过综合比较，选用吸附量和解吸率均较高的HPD100型号树脂进行纯化蓖麻总黄酮的后续试验。

表1 不同树脂对蓖麻总黄酮的吸附性能Tab.1 Adsorption properties of different resins on total flavonoids from castor

2.2 上样流速与上样体积对蓖麻总黄酮纯化作用的影响

HPD100型树脂动态泄露曲线，分别以不同的流速1、2和3 BV·h-1上样，上样流速越大泄漏点出现越早，上样流速大会使样液中的部分总黄酮未能与树脂充分接触、吸附而流出，以3 BV·h-1的流速上样，在流出液体积80 mL 时出现了泄漏点；当上样流速为1、2 BV·h-1时，泄露点分别在140 mL 和120 mL 出现（图1）。考虑到纯化效率和时间成本，选择2 BV·h-1为最佳上样流速，120 mL为最佳上样体积。

图1 HPD100树脂动态泄露曲线 Fig.1 Dynamic leakage curve of HPD100 resin

2.3 上样液浓度对吸附率的影响

随上样浓度的逐渐增加，总黄酮的吸附率呈先升高再降低趋势，0.98 mg·mL-1时吸附率最高，见图2。总黄酮浓度较低时，树脂孔径吸附不完全，而总黄酮浓度较高时，溶液中的醇溶性杂质增加会与黄酮化合物竞争树脂的吸附位点，使得吸附率降低。

图2 上样浓度对吸附作用的影响Fig.2 Effect of loading concentration on adsorption

2.4 pH对大孔树脂吸附作用的影响

pH对吸附率的影响较大，随pH的增加，树脂对蓖麻总黄酮的吸附能力降低（图3）。由于黄酮化合物是多羟基酚类，在酸性条件下易被树脂吸附，而碱性条件下其结构改变不易被树脂吸附［16］，故在pH为4时吸附率最高。

图3 不同pH对吸附作用的影响Fig.3 Effect of different pH on adsorption

2.5 洗脱液浓度的选择

随乙醇浓度的增加，吸附在树脂上的黄酮化合物解吸能力也不断增强，乙醇浓度为70%时，解吸率最大（图4），说明在此浓度下，大部分被吸附的总黄酮被洗脱下来，乙醇浓度继续增加时，可能会将吸附的杂质也洗脱下来，影响试验结果，故洗脱浓度定为70%乙醇，较为合适。

图4 不同洗脱浓度下的解吸率Fig.4 Desorption rate at different elution concentrations

2.6 洗脱流速、洗脱液体积对大孔树脂解吸作用的影响

洗脱流速为4 BV·h-1时，解吸曲线峰值最早出现，而且出现拖尾现象，说明洗脱液流速过大洗脱液未与吸附物充分接触，致使解吸效果不理想。洗脱流速为2 BV·h-1时，使用解吸液体积较大为130 mL，洗脱效果不佳，洗脱效率低。洗脱流速为3 BV·h-1时，流出液浓度较为集中，洗脱效率高。综上，选择洗脱流速为3 BV·h-1，洗脱体积为100 mL（图5）。

图5 解吸曲线Fig.5 Desorption curves

图6 蓖麻总黄酮、Vc对DPPH的清除能力Fig.6 DPPH scavenging ability of total flavonoids and Vc from castor

2.7 验证试验

在最佳纯化条件下进行3 组平行试验，得到纯化后蓖麻叶总黄酮纯度分别为55.84%、56.21%、56.97%，平均值为56.34%（RSD=1.02%）。结果表明，该条件下对蓖麻总黄酮进行纯化效果好且试验重复性好。

2.8 蓖麻总黄酮对DPPH自由基清除能力

蓖麻总黄酮对DPPH的清除能力随着浓度的增加而增大，但对于DPPH的清除能力低于Vc，蓖麻总黄酮质量浓度为1.0 mg·mL-1时，对DPPH的清除率为78.51%。

3 讨论与结论

大孔树脂由于极性和粒度大小不同，对物质的吸附、解吸能力也不同，即使对于同一类物质，其吸附能力也有所不同，其吸附与解吸能力还因样品溶剂种类、洗脱剂种类和浓度、上样流速及洗脱流速等因素的不同而产生差异。陈素雯等［12］从6 种不同类型的大孔树脂中筛选纯化龙脷叶总黄酮的试验中发现，AB-8型纯化效果最佳。王林美等［17］纯化柞树叶总黄酮的试验中，筛选出最佳的大孔树脂为D101型。而在本试验中，适用于纯化蓖麻叶总黄酮的大孔树脂为HPD100型。

利用HPD100型大孔树脂纯化蓖麻总黄酮，最佳工艺条件为上样浓度0.98 mg·mL-1、pH为4、上样流速为2 BV·h-1、洗脱剂70%乙醇、洗脱流速为3 BV·h-1，蓖麻叶总黄酮纯度由纯化前的19.48%增加至56.34%，提高了2.89倍。纯化后的蓖麻总黄酮质量浓度为1.0 mg·mL-1时，对DPPH的清除率为78.51%。