AKR7A5基因敲除对雄性小鼠生殖的影响

刘庆玲,赵振军,徐文秀,孔令英,刘笑含,许文达,董思琳,李 岩,石 慧

(烟台大学生命科学学院,山东 烟台 264005)

醛酮还原酶(Aldo-keto reductase,AKR)7A5是醛酮还原酶的第7个亚家族(Aldo-keto reductase family 7 member,AKR7A)成员[1-3],是HINSHELWOOD等2002年从小鼠肝脏中鉴定出的一种新醛酮还原酶,其可将体内多种醛或酮还原为毒性较小或无毒性的相应的醇,从而保护机体免受有毒醛或酮的损害[2]。国内外对AKR7A5的研究多集中在醛酮还原酶特性上[4-5],且研究仅限于体外细胞培养层面[6-7],在生殖方面研究较少。

目前不孕不育率逐年升高[8],人类不育的遗传原因大多还不清楚[9],通过小鼠基因敲除模型可为揭示人类不育的遗传原因提供理论依据[10-12]。实验室前期的人附睾差异蛋白质组学研究发现,人AKR7A2基因可能对睾丸、附睾精子有重要作用[13]。由于使用人类配子进行研究存在伦理和技术问题[14-15],且小鼠AKR7A5与人AKR7A2的氨基酸序列有89%同源性[2],因此,本研究利用AKR7A5基因敲除小鼠模型,在活体水平考察该基因对小鼠生殖的影响,为人类不育研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

AKR7A5基因敲除型小鼠由山东大学惠赠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因型鉴定 剪取小鼠尾尖,用动物基因组DNA快速抽提试剂盒(D0065S,碧云天)提取小鼠基因组DNA。AKR7A5基因鉴定使用两对引物,分别是Primer F1:5′-AAGGATCTCCATGCTTTCAGGC-3′;Primer R1:5′-ACAGCATCCTGACAATACCTAGGAAC-3′;Primer F2:5′-GCACCCTCTCTGCTAGTTGG-3′;Primer R2:5′-GGCAGTAGAGTTGGCTTGGCA3′。PCR反应体系(50 μL)如下:2×taq plus master mix 25 μL、DNA模板2 μL、引物F/R(10 μmol/L)各2 μL、加入双蒸水至50 μL。PCR反应程序为:预变性94 ℃×3 min;变性94 ℃×30 s;退火57 ℃×30 s;延伸72 ℃×50 s(30个循环);最终延伸72 ℃×7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,于凝胶成像仪系统拍照观察。AKR7A5基因敲除型小鼠可见引物F1-R1扩增出来的573 bp条带,野生型小鼠可见引物F2-R2扩增出来的742 bp条带,同时扩增出上述两种条带的小鼠即为杂合型。

1.2.2 小鼠睾丸、附睾系数测定 选择2.5月龄野生型和AKR7A5基因敲除型小鼠各6只,称量其体重、睾丸重、附睾重。按照脏器重(g)/体重(g)×100% 计算脏器系数[16]。

1.2.3 睾丸、附睾组织切片及苏木精-伊红(HE)染色 处死小鼠并分离睾丸和附睾,快速放入4%多聚甲醛溶液中,室温固定12 h,制备组织切片并进行HE染色,显微镜下观察野生型与AKR7A5基因敲除型小鼠组织形态差异并拍照保存。

1.2.4 精子活力测定 取野生型和AKR7A5基因敲除型雄性小鼠各6只,断颈处死,将附睾迅速放进1 mL预热的磷酸缓冲盐溶液中,用眼科剪将附睾尾部剪成几段,37 ℃孵育10 min。吸取10 μL含小鼠精子的PBS溶液,采用计算机辅助精子分析仪分析精子的浓度和运动参数。

1.2.5 生育力测定 将3只AKR7A5基因敲除型雄性小鼠(2.5月龄)、3只野生型雄性小鼠(2.5月龄)分别与生育力正常的成年野生型雌性小鼠交配,按照雄性∶雌性=1∶3的比例合笼。记录4个月的总产仔数、每窝产仔数及窝数以进行统计学分析。

1.2.6 统计学分析 本研究数据利用SPSS ver.21软件,采用单因素方差分析方法处理,统计结果用平均值±标准差表示。当P<0.05,P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠基因型鉴定结果

提取鼠尾DNA进行PCR扩增,电泳结果见图1。A、B、C、D、E为AKR7A5基因敲除杂合型小鼠合笼所生子代小鼠,其中小鼠C只出现一条约742 bp的条带,为野生型;小鼠D、E只出现一条约573 bp的条带,为AKR7A5基因敲除型;小鼠A、B出现约573 bp和742 bp的两条带,为杂合型。

M为DL 2000 Marker;泳道1、3、5以F1-R1为引物扩增,泳道2、4、6以F2-R2为引物扩增。

2.2 小鼠睾丸、附睾系数

饲养过程中AKR7A5基因敲除型小鼠的毛发、精神和活动量等生活状态良好。分别选取野生型和AKR7A5基因敲除型2种基因型雄性小鼠各6只,各组小鼠睾丸和附睾系数见表1,AKR7A5基因敲除型小鼠睾丸、附睾系数与野生型小鼠相比差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 小鼠睾丸、附睾系数

2.3 睾丸、附睾切片

为了进一步确证AKR7A5基因敲除对小鼠睾丸与附睾组织发育的影响,利用组织病理切片 HE染色技术,观察分析2组基因型雄性小鼠的睾丸与附睾组织形态(图2)。结果显示野生型和AKR7A5基因敲除型雄性小鼠睾丸组织曲细精管均结构清晰,管壁基膜完整,各级生精细胞排列紧密规则,两者无明显差异(图2(a)、2(d))。两种基因型小鼠附睾头和附睾尾的生精小管结构均正常,附睾尾管腔内具有成熟精子,但AKR7A5基因敲除型小鼠附睾尾的成熟精子数量明显少于野生型小鼠(图2(b)、(c)、(e)、(f))。

图2 两种基因型小鼠睾丸、附睾切片

2.4 精子质量分析

与野生型雄性小鼠相比,AKR7A5基因敲除型小鼠的精子浓度、精子直线前游总数、直线运动精子、前向运动精子、平均路径运动速度和平均曲线运动速度数值均显著降低(P<0.01);平均直线运动速度数值降低(P<0.05);不运动精子数值显著升高(P<0.01);而两种基因型小鼠精子的非前向运动精子、平均头部侧摆幅值、精子平均鞭打频率、运动的直线性和运动的前向性等方面的差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 两种基因型小鼠精子分析情况

2.5 生育力测定

由表3可见,野生型小鼠平均每胎产仔数为7.97±0.42只,AKR7A5基因敲除型小鼠平均每胎产仔数为6.27±0.90只。4个月内野生型小鼠和AKR7A5基因敲除型小鼠产仔窝数相比差异无统计学意义(P>0.05);4个月内AKR7A5基因敲除型小鼠总产仔数比野生型小鼠显著降低(P<0.01)。

表3 生育力测定结果

3 讨 论

本研究发现AKR7A5基因敲除可影响小鼠成熟精子的数量和活力、降低总产仔数[17],即AKR7A5基因对小鼠生殖具有重要的影响。有研究报道精子易受活性氧等氧化代谢产物攻击,异常增多的活性氧介导氧化应激则可引起精子发生障碍、数量及活动度下降[18-19],AKR7A5酶可以减少活性氧的含量,从而对氧化应激的细胞有保护作用[6-7]。推测AKR7A5基因敲除会造成生殖系统活性氧增多,引起精子的氧化损伤,进而对生育力造成影响。

对于小鼠睾丸、附睾系数以及组织形态,发现AKR7A5基因敲除型小鼠和野生型小鼠没有统计学意义。推测AKR7A5作为AKR超家族的成员之一,其在组织中的功能可被其他成员代偿,例如 AKR1B酶[20-22]和AKR1B7酶[23]。

综上,AKR7A5基因敲除影响小鼠成熟精子的数量和活力,降低总产仔数。其潜在的分子机制还有待于进一步研究。