纤维素分解固氮菌强化农林业废弃物堆肥研究进展

杨杰 娄正伟 蒙归 申银华

贵州省从江县林业局林长制工作服务中心，贵州 从江 557400

农林业废弃物资源在全球大量存在，是堆肥的有效富碳原材料，然而，在许多国家，农林业废弃物往往在收获后被焚烧，以方便农民快速整地，因此导致大面积的环境污染和植物资源的流失［1］。大量的农林业废弃物是由伐木工业和农业生产产生的，这些农林业废弃物对于改善土壤理化性质和治理水土流失很有价值，但如果没有适当处理，如好氧堆肥，则会造成环境污染等问题。因此，探索具有低成本、快速和科学处理农林业废弃物的更好替代方法，以解决环境问题是至关重要的，也是农林业可持续发展中最大的挑战之一。

研究表明，好氧堆肥是一种环保的、可持续的农林业废弃物的处理方法。这种自然的生物过程通过将农林业废弃物转化为养分丰富的腐熟堆肥，有效促进了农林业的可持续发展［2］。此外，腐熟堆肥可以用作土壤改良剂、植物种子萌发和生长发育的促进剂，从而减少农林业生产过程中对化肥的依赖。最近的腐熟堆肥施用研究结果表明，腐熟堆肥的施用对生态恢复和气候调节有积极作用，可以补充土壤养分、促进植物生长发育、减少空气和水污染等［3，4］。未腐熟的堆肥可能会对植物产生有害的化合物，进而影响种子萌发和植物生长发育。所以，堆肥最终需要达到腐熟和稳定，以保证不对植物生长发育产生不利影响。

富含碳的木质纤维素农林业废弃物的氮含量较低，自然状态下的堆肥周期长，由于农林业废弃物的降解和转化是堆肥过程中微生物代谢的结果，所以在堆肥过程中接种具有固氮和纤维素分解特性的微生物可以克服这一局限性［5］。研究报道的纤维素分解固氮菌，如氮单胞菌属、寡养氮单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属、多粘类芽孢杆菌属和葡萄糖杆菌属等均能产生木质纤维素分解固氮酶［6］。此外，接种具有纤维素分解固氮特性的不同菌剂已被证明可以通过增加农林业废弃物堆肥过程中关键酶的活性来促进木质纤维素的分解［7］。与真菌群落不同，纤维素分解固氮细菌不需要提供额外的氮源，因为它们可以通过固定大气中的N2来满足自身对氮的需求。农林业废弃物成功并快速的堆肥在很大程度上取决于堆肥过程中微生物群落的分解固氮能力，所以在堆肥材料中接种纤维素分解固氮菌，在农林业废弃物堆肥处理过程中显示出了绝对的优势。

虽然过去对农林业废弃物堆肥的研究已经有了大量的报道，但本综述专门对纤维素分解固氮菌的功能、机理、发展趋势及其在农林业废弃物堆肥中的潜在应用进行详细而全面的总结。还讨论了腐熟堆肥在可持续农林业生产实践过程中的应用前景，以期为高原地区农林业的高质量发展提供基础的理论参考。本文逻辑结构框架图如图1所示。

图1 逻辑结构框架图

1 纤维素分解固氮菌

1.1 纤维素分解固氮菌的定义

纤维素分解固氮菌是一类能产生纤维素酶将纤维素分子分解成单糖，并产生固氮酶催化大气中氮气转化为固定氮(NH3)的一类微生物。这类微生物有助于将木质纤维素和其他纤维素资源转化为腐熟堆肥，从而提高碳水化合物中养分的利用率和较高的可同化氮水平［8］。木质纤维素在有氧条件下最终转化为二氧化碳和水，在厌氧条件下最终转化为二氧化碳、水和甲烷，大多数纤维素分解微生物为细菌或真菌。

1.2 纤维素分解固氮菌的作用机理

通过木霉菌对木质纤维素分解机理的深入研究，发现微生物对木质纤维素的分解过程涉及三种酶的协同作用：内切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶（纤维生物水解酶）和β-葡萄糖苷酶。内切葡萄糖苷酶随机切割纤维素链上可获得的分子内的β-1,4-糖苷键，以产生新的链端；外切葡萄糖苷酶逐渐分解纤维素链的两端，释放可溶性的纤维二糖或葡萄糖分子，β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖，从而分解纤维二糖［9］。大多数分离的木质纤维素分解细菌属于需氧量高的放线菌属（放线菌门）和厌氧的梭菌属（厚壁菌门）［10］。好氧细菌和厌氧细菌在其纤维素分解策略上有明显的差异，厌氧菌主要通过复杂的纤维素酶系统分解纤维素，需氧纤维素分解菌通常采用游离纤维素酶系统，在该系统中产生多种酶协同作用。好氧细菌利用纤维素作为碳源和能源，通过分泌大量的内生酶和外生酶分解纤维素［11］。在所有的纤维素降解微生物中，需氧细菌是最重要的分解者，它们被称为堆肥益友。

1.3 纤维素分解固氮菌的发展前景

近年来，真菌和细菌因能产生多种纤维素酶和半纤维素酶而受到越来越多的关注，这些木质纤维素降解微生物因为能对地球上丰富的有机物木质纤维素进行循环利用，因此在生物圈中发挥着重要作用。目前，已经鉴定出几种细菌属可以产生纤维素酶和固氮酶，如芽孢杆菌属［12］，偶氮杆菌属、偶氮单胞菌属［13］，寡养单胞菌属，假单胞菌属，类芽孢杆菌属，葡萄糖杆菌属，偶氮螺旋菌属，假黄单胞菌属和根瘤菌属等［14］。

真菌是产木质纤维素分解酶的主要菌类，其中曲霉属、青霉属和木霉属是产木质纤维素酶最高的真菌菌株。然而，细菌也被认为是木质纤维素生物降解的关键微生物，细菌通常比真菌繁殖快，它产生的木质纤维素分解酶对高温更具有耐受性。其次，农林业废弃物堆肥原材料缺乏氮，因此阻碍了农林业废弃物的生物转化过程，但是细菌可以通过生物固氮作用来满足其自身对氮的需求，所以纤维素分解固氮菌比那些需要额外提供氮源的微生物更有利于对木质纤维素类农林业废弃物的分解。

研究表明，在堆肥过程中参与氮转化的关键微生物大多是纤维素分解菌。从堆肥材料中分离出的固氮细菌属，如短营养单胞菌属、黄单胞菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、碱性钙根菌属、无色杆菌属和茎菌属等［15］，此前已被证明了参与堆肥过程中的有机物分解。大多数纤维素分解固氮细菌，特别是芽孢杆菌和链霉菌，具有在高温下仍能正常生长的特点，它们在高温期仍能生存的优势无疑会影响堆肥过程和堆肥质量［16］。此外，纤维素分解固氮菌作为微生物菌剂接种，可以使堆肥的有机碳总量和C/N 比降低幅度更大，使堆肥的总氮、总磷、总钾水平提高，从而提升堆肥的品质。

利用纤维素分解固氮菌作为微生物菌剂对富含木质纤维素类的农林业废弃物进行堆肥，以提高堆肥工艺和腐熟堆肥的品质已得到广泛的研究。Kausar等人［17］从水稻秸秆混合材料中分离出了25 株木质纤维素分解菌，发现纤维素分解固氮的碳酸盐小单孢菌是最佳的木质素分解菌和纤维素分解菌，然后，他们将碳酸盐小单孢菌加入另外的稻草堆肥中，与对照组相比，观察到这种细菌能够显著地分解纤维素、半纤维素，并降低了腐熟堆肥的碳含量，在研究中，C/N 在6 周内从29.3 降低到18.1，证实了该菌在大规模富含木质纤维素类农林业废弃物堆肥中的潜力。在评价微生物菌剂对柑橘果皮堆肥的影响时，Wang 等人［18］在工厂化规模和实验室规模的柑橘果皮堆肥中接种了芽孢杆菌属、鞘氨醇杆菌属和糖单孢菌属等纤维素分解固氮菌，发现接种这些菌剂：（1）有助于丰富堆体中微生物群落的多样性；（2）增加堆体温度；（3）促进果胶和纤维素的分解。另外他们还观察到工厂化规模的腐熟堆肥比实验室规模的腐熟堆肥的养分更丰富，这也证明了这些菌剂在大规模富含木质纤维素类农林业废弃物堆肥过程中的潜在作用。上述研究结果表明，通过接种纤维素分解固氮菌为有效和可持续的处理富含木质纤维素类的农林业废弃物的堆肥开辟了新的路径。

2 好氧堆肥

2.1 好氧堆肥的定义

好氧堆肥是一种将农林业废弃物转化为资源的传统方法，在微生物群落的作用下，将可生物降解的有机农林业废弃物分解成养分丰富的有机肥。腐熟的堆肥产品可以增加土壤肥力、提高土壤生产力、提升土壤的水源涵养能力、促进植物种子萌发和生长发育。好氧堆肥长期以来一直被用于处理有机固体废弃物，特别是农林业废弃物，以便有机物质可以快速通过微生物分解，转化为稳定且安全的富含养分的腐熟堆肥产品，循环利用到农林业生产实践中［19］，堆肥过程受物理因素、化学因素和微生物因素的调控。

2.2 木质纤维素类农林业废弃物好氧堆肥预处理方法

木质纤维素生物质由于其固有的复杂性和多样性而使得在自然状态下很难被微生物分解，因此，提高木质纤维素类农林业废弃物堆肥的效率需要对木质纤维素类农林业废弃物进行预处理。这样可以破坏木质纤维素生物质致密的分子结构，以促使纤维素和半纤维素更易被酶水解［20］。木质纤维素农林业废弃物堆肥的预处理方法主要有三种：物理方法、化学方法和生物方法。这些方法有助于在堆肥过程中促进农林业废弃物的快速分解、水分管理、杀死病原体以及分解纤维素、半纤维素和木质素成分。各种预处理方法各有优缺点，应用于不同原料的预处理结果也各不相同。

2.2.1 化学预处理。由于化学预处理方法在增强各种木质纤维素生物质的生物转化方面更有效，因此化学预处理方法比物理方法和生物方法更常用于堆肥的预处理过程。用于促进堆肥过程的常用化学试剂有氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、过氧化氢、硫酸、盐酸和芬顿试剂等［21］。例如，芬顿试剂预处理已被证明可以通过增强木质纤维素降解酶的功能和重塑秸秆堆肥过程中的细菌群落来提高木质纤维素的生物转化效率［22］。但是，这些化学药品预处理后的残留物如果释放到环境中，可能会造成环境污染，如食物网的改变、水和土壤污染等，因此在堆肥过程中不建议使用化学预处理方法，避免对环境产生二次污染。

2.2.2 物理预处理。物理预处理主要是通过机械粉碎破坏生物质中的木质纤维素结构，降低木质纤维素材料的结晶度和颗粒尺寸，从而增加农林业废弃物的可接触表面积和孔隙度，降低聚合度，以促进纤维素水解。目前用于农林业废弃物的物理预处理方法有机械预处理、热预处理、压力预处理和辐射预处理等［23］。不同类型的物理过程、机械预处理方法，包括研磨和粉碎，主要用于降低原材料尺寸以促进木质纤维素原材料的酶促降解。

关于农林业废弃物堆肥的传统物理预处理技术的应用，目前的研究还很少。在此背景下，堆肥技术最近的发展得益于一种新型的超高温厌氧预处理方法，它使用一个可调节温度的超高温厌氧预处理木质纤维素生物质的反应堆进行预热，后面跟传统的堆肥一样接种腐熟堆肥作为菌种来源［24］。目前，超高温厌氧预处理的方法是在100℃下处理2h，温度根据堆肥材料而调整。多项研究表明，超高温厌氧预处理方法可能是农林业废弃物堆肥过程中最佳的物理预处理方法。原因如下：（1）超高温厌氧预处理可以对木质纤维素生物质的反应堆进行预热和调节微生物群落的产生，从而提高堆肥的腐熟度［25］；（2）超高温预处理降低了蛋白酶、脲酶的酶活性和氨氧化菌的丰富度，从而提高氮固定率［26］；（3）超高温预处理降低了有机固体废弃物堆肥过程中含氨、氮等物质的恶臭气体的排放［27］。

与化学预处理不同，物理预处理不会对植物造成毒害作用，是一种环保的预处理方法。然而，考虑到能源消耗和不能去除生物质中木质纤维素成分，并且大多数物理预处理过程费时、成本高，因此在堆肥过程中化学预处理和物理预处理方法均不太推荐使用。

2.2.3 生物预处理。生物预处理包括改变细胞壁中的木质纤维素结构、酶水解、接种微生物预处理，接种的微生物包括白腐菌、褐腐菌、软腐菌和产生细胞外酶的细菌等［28］。在不同种类的木腐真菌中，担子菌属白腐真菌对木质纤维素生物质的预处理最为有效，因为它们在木质素水解方面比褐腐真菌和软腐真菌更活跃。与真菌预处理不同，细菌预处理主要以木质素为目标，由放线菌等细菌组成的微生物群落具有较高的半纤维素酶活性和纤维素酶活性［29］。为了提高木质纤维素生物质的生物转化率，通常在木质纤维素生物质生物预处理之前或过程中使用主要来自细菌和真菌氧化和水解的酶。

生物预处理方法比物理预处理和化学预处理方法有很多优点，如，生物预处理方法环保、经济、低能耗等。一般来说，大多数传统的化学、物理预处理方法，由于成本高，以及大量化学药品的使用会造成环境污染，因此对于大规模的堆肥是不能实现的［30］。因此，需要进一步研究探索适合木质纤维素类生物质堆肥的新的、绿色的、快速的和低成本的生物预处理方法。

近年来，接种外源微生物对堆肥品质和堆肥腐熟度的积极作用受到了广泛的关注。从理论上讲，堆肥过程不需要特殊的微生物菌剂，因为在堆肥原材料中存在各种各样的好氧微生物。然而，大量研究表明，为了在短时间内使堆肥腐熟，需要接种特定的微生物菌剂。如，在以木质纤维素类废弃物作为堆肥原材料的堆肥过程中接种三种分离得到的细菌可以加快木质素的分解和提高腐熟堆肥的品质［31］。添加含有绿色木霉、黑曲霉和黄曲霉孢子悬浮液的嗜热真菌群落显著增强了城市有机固体废弃物堆肥过程中的腐殖化作用［32］。

微生物菌剂接种处理作为影响木质纤维素生物质堆肥效率的重要参数近年来受到越来越多研究人员的关注，因为用筛选培养得到的木质纤维素分解微生物接种到富含木质纤维素类农林业废弃物的堆肥过程是一种可持续的、环保的新途径，可以提高堆肥效率并改善腐熟堆肥的品质。

3 腐熟堆肥产品在农林业生产实践中的应用

腐熟堆肥是微生物对可生物分解物质进行好氧分解的最终产物，化肥仅仅只能为植物提供养分，并且会造成土壤板结，产生面源污染。而腐熟堆肥产品不仅可以提高土壤有机质含量、还能增强土壤抗侵蚀的能力、地下水的保持能力、固碳的能力和植物的抗病性［33］。

3.1 施用腐熟堆肥可以有效降低空气污染

尽管世界科学技术在飞速发展，但空气污染仍然是当今社会亟待解决的问题，如果长期下去不采取科学合理的对策，可能将会对生物多样性和自然生态系统产生更大的毁灭性破坏［34］。农林业生产活动如露天焚烧作物秸秆和园林废弃物、使用杀虫剂、农药和化肥等被认为是造成空气污染的重要原因之一。堆肥已被证明了是一种可以减少温室气体排放的新技术，腐熟稳定的堆肥施用到土壤中后，可以被植物循环吸收利用，不会产生空气污染，因此，在农林业生产过程中应考虑施用腐熟堆肥，以减少空气污染［35］。

3.2 腐熟堆肥在防治水土流失中的作用

腐熟堆肥是一种自然的、安全的和环保的产品，可以恢复退化土壤的有机肥力，并提供诸如养分、植物激素、抗氧化剂和酶等促进植物生长发育的物质。各种有机废弃物的腐熟堆肥已被有效用于防治土壤侵蚀和沉积的研究中，有研究表明，施用腐熟堆肥后可以减轻水土流失，较大程度的改善水质，补充土壤中被植物吸收的养分并促进植物的生长［36］。Demars等人［37］报道，与裸地相比，施用腐熟堆肥减轻了86%的土壤侵蚀；与草方格相比，施用腐熟堆肥后土壤沉积物对周围水体的冲刷量减少了99%；与地膜覆盖相比，施用腐熟堆肥后可以使土壤渗透效果增加125%。在高度侵蚀地区(如建筑工地)施用腐熟堆肥被认为是减轻土壤径流、侵蚀和加快植被恢复的可供选择的方法［38］。Huang 等人［39］最近研究了腐熟堆肥作为一种低成本且高效的有机改良剂来恢复在农林业生产实践过程中被重金属污染的土壤。以上研究表明，在农林业生产实践过程中施用腐熟堆肥可作为水土流失治理的新路径。

3.3 腐熟堆肥在促进植物生长发育中的作用

施用腐熟堆肥作为土壤改良剂，可以为土壤提供氮、磷、钾、硫、镁、锰、铜、钙和铁等微量营养元素，并释放作为代谢产物的有机碳或二氧化碳，促进植物的生长发育。Lazcano 等人［40］研究了腐熟堆肥对番茄植株生长和形态的影响，结果表明，与在泥炭中生长的番茄相比，使用腐熟堆肥作为培养基质显著促进了番茄茎部和根系的生长，建议使用腐熟堆肥代替泥炭作为番茄植株栽培的基质。徐东等人［41］的研究结果显示，添加园林废弃物的腐熟堆肥有效增加了青稞的株高，随着园林废弃物腐熟堆肥施用量的增加，青稞产量均提高。卢赟等人［42］的研究表明，利用园林废弃物的腐熟堆肥作为栽培基质，不仅可以改善土壤理化性质，还可以促进花卉的生长，增加花卉产量。另一项研究表明：将园林废弃物和中药渣共堆肥的腐熟堆肥作为栽培基质，比泥炭土和黄壤土基质更适合景天三七、紫背天葵、硫华菊盆栽使用，可作为新型基质在相关花卉盆栽中推广应用［43］。余韵等人［44］的研究发现，土壤中添加10%的园林废弃物的腐熟堆肥可显著提高楸树苗木形态指标和叶绿素含量，使苗高增长量、地径、总生物量、总叶绿素含量分别增加8%、5%、19%和40%。王晔青等人［45］的研究显示，添加适当比例的园林废弃物的腐熟堆肥产品可明显促进鸡冠花的生长，提高其观赏品质。综上所述，在农林业生产实践过程中将农林业废弃物进行堆肥处理，不仅可以解决环境污染和资源浪费问题，还可以将腐熟后的堆肥从新循环到农林业生产实践过程中，为农林业的可持续发展开辟了新的路径。

4 结论与展望

（1）纤维素分解固氮菌在堆肥中的应用已被证明是将木质纤维素生物质重新循环到土壤中并改良土壤理化特性和生物特性最环保和最快的方法。接种纤维素分解固氮菌可以缩短堆肥周期，加快富含木质纤维素类农林业废弃物的堆肥进程，并通过降低碳氮比减少了有害气体的排放，最终提高了腐熟堆肥的品质。

（2）利用纤维素分解固氮菌对富含木质纤维素类的农林业废弃物进行堆肥是一种可行的科学途径，减少了由于焚烧作物秸秆和使用化肥所造成的空气和水污染，解决了因垃圾填埋而占用土地的问题，为农林业的可持续发展开辟了新的路径。

（3）施用养分丰富的腐熟堆肥产品可以增加土壤中微生物的生物碳量、有机质和氮、磷、钾总浓度，还可以防治土壤的侵蚀、径流和沉降过程，为高原地区的水土流失治理提供新的选择路径。

（4）木质纤维素类农林业废弃物堆肥技术进一步深入的研究应该探索：1)木质纤维素农林业废弃物堆肥过程中纤维素分解固氮菌群落的演替与堆肥过程中臭味气体和温室气体排放及养分固定的内在机理；2)纤维素分解固氮菌作为微生物菌剂在大规模的木质纤维素类农林业废弃物堆肥中的应用；3)堆肥过程中每个阶段关键微生物群落的协同效应与腐熟堆肥品质、各种养分固定之间的内在机理。