用RT-qPCR方法评价4个不同猪品种骨骼肌候选内参基因

陈薪全，潘宇恒，敬云鸿，牛丽莉，甘麦邻，赵 叶，陈 蕾，沈林園*，朱 砺*

（1.四川农业大学畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，成都 611130；2.四川农业大学动物科技学院/农业农村部畜禽生物组学重点实验室，成都 611130）

逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)以其简便、灵敏、准确的优势，成为测定各种生物样品中基因表达水平最常用的方法[1]。具有稳定表达水平的内参基因是调节和监测基因在不同处理或条件下表达变化的内在控制。因此，为了避免偏差，必须考虑RNA提取率、逆转录细节和RT-qPCR性能等几个方面[2-4]。同时，需要选择合适的内参基因来规范目的基因的表达，获得可靠、可重复的结果。理想的内参基因应在各种条件下稳定表达，选择合适的内参基因可提高基因表达检测的准确性和再现性[5]。

内参基因通常被称为管家基因，由于其表达的稳定性，在分子生物学研究中最初被用作规范基因表达的参照[6-7]。这些基因如GAPDH、ACTB、18S rRNA和Tublin是组成性表达的，因为它们是基本机体维持所必需的，并且它们已经在Western和Northern印迹实验中被选择作为加载对照[1]。然而，在使用RT-qPCR等更灵敏的技术时，这些经典内参基因的表达在不同类型的组织中以及在不同的实验处理后可能存在很大差异[8-9]。但是，内参基因或任何其他基因只要在满足实验的条件下保持恒定的表达，有限的变异是可以接受的[10]。因此，在进行RTqPCR实验之前，应该对候选内参基因进行验证。

为了准确测量基因表达水平，建议采用多个候选内参基因进行归一化，而不是选择某一个来校准。目前已经开发了多种用于鉴定内参基因表达水平稳定性的算法软件包，较为常用的算法有geNorm、NormFinder 和BestKeeper[10-12]。但运用不同算法处理后得到的最稳定的内参基因并非完全相同。在这些统计算法的帮助下，目前已有许多关于选择合适内参基因的研究报道[13-16]。

在本研究中，我们检测了4 个不同猪品种骨骼肌中8 个候选内参基因的表达水平，并运用3 种常用算法分析其表达稳定性。2009年，一篇论文报道了评估RT-qPCR 实验所需的信息，名为MIQE 指南[17]。在此背景下，本研究旨在探讨4 种不同猪品种骨骼肌中最合适的内参基因，为内参基因的选择提供依据，并为今后的基因表达研究提供参考。

1 材料方法

1.1 实验材料

本研究中使用的组织样品来源于6头360日龄藏猪骨骼肌、6头200日龄成华猪骨骼肌、6头160日龄DLY商品猪骨骼肌、3头160日龄LY商品猪骨骼肌，以及8 个DLY 商品猪骨骼肌原代细胞样，样品采集后迅速置于液氮中并进一步在-80 ℃条件下保存。所有动物研究均经中国四川省四川农业大学动物科技学院机构动物伦理与福利委员会批准，许可证号：DKY-B20131403(中国科技部，2004年6月15日批准)。

1.2 RNA提取和cDNA合成

用TRIzol试剂(TaKaRa，大连，中国)按照生产商的说明，从猪的组织(用剪刀切割)和细胞(直接裂解)中提取总RNA。RNA 提取后，使用NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)检测RNA 浓度(>200 ng/µL)和纯度(1.8

1.3 实时定量PCR

实时定量PCR(RT-PCR)使用SYBR Premix Ex Taq 试剂盒(TaKaRa，大连，中国)在CFX96 实时PCR检测系统(Bio-Rad,Richmond，CA，USA)上使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2×)(TaKaRa)进行。用2-ΔΔCt方法计算mRNA 的相对表达量[18]。RT-qPCR 所使用引物序列见表1。

表1 候选内参基因引物信息Table 1 Primer information of candidate reference genes

1.4 统计分析

为了评价候选内参基因的稳定性，采用了ge-Norm、NormFinder 和BestKeeper 等各具优势的内参基因归一化算法各筛选了3个内参基因。根据公式2-ΔΔCt将循环阈值（cycle threshold value，Ct）转换为非归一化相对量。geNorm 和NormFinder 的计算基于这些Ct值转换后的数据，而BestKeeper 则直接使用原始Ct值分析。

2 结果

2.1 不同猪种骨骼肌候选内参基因的循环阈值(Ct)离散度评价

我们通过RT-qPCR检测了29个骨骼肌样本中8个候选内参基因的表达情况。各个内参基因在不同样品中的Ct值分布如图1所示，8 个候选内参基因在所有骨骼肌样本中均有表达，但其表达量在不同猪种骨骼肌中存在一定差异。在所有候选内参基因中，GAPDH的Ct值平均值最低(14.49)，TBP的Ct值平均值最高(25.81)。Ct值分散较小的是TBP、RPL4、B2M和HPRT，这提示我们它们似乎是在这些样品中表达稳定性最高的基因，而YWHAZ则似乎是在这些样品中表达稳定性最低的基因。

图1 箱线图显示所有骨骼肌样品的候选内参基因的Ct值范围Figure 1 Box-and-whiske plot shows the range of Ct values of candidate reference gene of all psoas muscle

为了进一步评估内参基因表达稳定性并确定合适的内参基因，我们使用了3 种较为常用的方法（geNorm、Normfinder 和BestKeeper 算法）来进行分析。

2.2 通过geNorm分析候选内参基因的稳定性

通过geNorm 软件计算8 个候选内参基因的平均表达稳定性M值。在M值小于1.5 的前提下，M值越小，基因表达稳定性越高。在所有骨骼肌样本中，从平均表达稳定性M值的大小来看，候选内参基因中M值最小的是TBP和HPRT，M值最大的是GAPDH，说明TBP和HPRT是8 个候选内参基因中最稳定的内参基因，而GAPDH是最不稳定的内参基因(图2A)。同样的方法应用于藏猪骨骼肌，结果表明HPRT和ACTB是最稳定的内参基因，而PPIA是最不稳定的内参基因(图2B)。在成华猪骨骼肌中，HPRT和RPL4是最稳定的内参基因，而PPIA是最不稳定的内参基因(图2C)。在DLY 猪骨骼肌中，RPL4和TBP是最稳定的内参基因，而PPIA是最不稳定的内参基因(图2D)。在LY猪骨骼肌中，B2M和RPL4 是最稳定的内参基因，而YWHAZ是最不稳定的内参基因(图2E)。在骨骼肌细胞样品中，PPIA和YWHAZ是最稳定的内参基因，而B2M是最不稳定的内参基因(图2F)。

图2 候选内参基因的平均表达稳定性值Figure 2 Average expression stability values of candidate reference genes

根据geNorm 算法纳入最不稳定内参基因后的归一化因子值计算两两变异系数(V)，并根据Vn/Vn+1的值确定最优内参基因的个数。如果Vn/Vn+1的值小于0.15，则n为候选内参基因的最优个数。在所有骨骼肌样本中，geNorm 得到的Vn/Vn+1值在0.132～0.316 之间，V2/V3值小于0.15，说明TBP和HPRT是最佳候选内参基因组合(图3A)。另一方面，藏猪、成华猪、DLY 猪、LY 猪和骨骼肌细胞样本的骨骼肌V2/V3的5 个值均小于0.15，说明进行归一化的候选内参基因的最优数量为2 个。因此，在藏猪骨骼肌中，最佳候选内参基因组合是ACTB和HPRT(图3B)。在成华猪骨骼肌中，最佳候选内参基因组合是RPL4和HPRT(图3C)。在DLY 猪骨骼肌中，最佳的候选内参基因组合是TBP和RPL4(图3D)。在LY猪骨骼肌中，最佳候选内参基因组合为RPL4和B2M(图3E)。在骨骼肌细胞样品中，最佳候选内参基因组合为YWHAZ和PPIA(图3F)。

图3 确定候选内参基因的最佳数量Figure 3 Determination of the optimal number of candidate reference genes

2.3 使用NormFinder 分析候选内参基因的稳定性

NormFinder 算法是通过计算基因表达稳定值对基因表达稳定性进行排序，从而筛选出最合适的内参基因。表2 的结果表明，在所有骨骼肌样本中，TBP和HPRT的基因表达稳定值最小，为0.024，因此，TBP和HPRT是最适候选内参基因。在藏猪骨骼肌样品中，最合适的内参基因是B2M。在成华猪骨骼肌中，最合适的内参基因是ACTB。在DLY 和LY 猪的骨骼肌中，最合适的内参基因都是RPL4。在骨骼肌细胞样本中，最合适的内参基因是PPIA。这些结果表明，NormFinder 算法得出的最适内参基因与geNorm 算法得到的最适内参基因相似。

表2 通过NormFinder程序分析基因稳定性值Table 2 Analysis of gene stability value by NormFinder program

2.4 利用BestKeeper分析候选内参基因的稳定性

BestKeeper 算法是根据标准偏差值(SD)和变异系数(CV)评估候选内参基因表达稳定性的，其通过低SD 值和低CV 值来确定最适候选内参基因。根据BestKeeper 分析得到的数据如表3所示，在所有骨骼肌样本中，最适内参基因为B2M。在藏猪骨骼肌中，最适内参基因是ACTB。在成华猪骨骼肌中，最适内参基因是GAPDH。在DLY 猪骨骼肌中，最适内参基因是GAPDH。在LY 猪骨骼肌中，最适内参基因是TBP。在骨骼肌细胞样品中，最适内参基因是PPIA。这些结果表明，通过BestKeeper 算法分析得到的最合适内参基因与geNorm 和NormFinder算法取得的最合适最适内参基因相似。

2.5 各候选内参基因在所有样本中的总体表达稳定性

为了获得所有研究样本中每个基因的整体表达稳定性，我们将所有骨骼肌样品中每个基因的排名通过计算加权平均值得到一个综合排名，最稳定表达的候选内参基因具有最小的排名平均值。表4的综合排名表明，HPRT在所有骨骼肌样品和藏猪骨骼肌中都是排名第1。在成华猪骨骼肌中，HPRT和ACTB是最适内参基因。在DLY 和LY 猪骨骼肌中，RPL4是最适内参基因。而在骨骼肌细胞样本中，PPIA是最适内参基因。

表4 候选内参基因表达稳定性综合排名Table 4 Candidate reference gene expression stability ranked by geNorm,NormFinder,and BestKeeper

3 讨论

在分子生物学研究中，RT-qPCR是基因表达研究中最经典的一项技术之一，它需要合适的内参基因来规范基因表达，选择合适的内参基因对于保证基因表达的准确性和再现性至关重要。在许多的动物基因表达研究中，最常用的内参基因是GAPDH和ACTB，因为它们具有较高的mRNA 表达稳定性[19]。正如先前的研究报道，GAPDH和ACTB在小鼠的心脏、肝脏、脾脏和胸腺4 个器官中稳定表达，符合内参基因的要求[20]。然而，在另一项研究中，GAPDH在人类卵巢肿瘤组织中的表达稳定性较低，在这一组织类型中不宜选择GAPDH作为内参基因[21]。这表明最合适的内参基因在不同的组织中是可变的、是不固定的。目前，对于合适候选内参基因的评估，绝大多数研究都集中在某一物种的特定组织上[22-23]。为了获得可靠且有意义的数据，研究者需要根据具体的样本和实验条件选择合适的内参基因。

对不同品种、不同发育阶段的生物学样本进行分析，才能更好地揭示内参基因的选择对基因表达的影响[24-27]。我们对研究频率较高的内参基因进行了筛选，共选择了8 个候选内参基因来进行探讨。选择了360日龄藏猪、200日龄成华猪这两个地方猪种的骨骼肌样品，以及160日龄DLY 商品猪和160日龄LY 商品猪的骨骼肌样品。对于不同品种的骨骼肌样品，运用不同的算法产生的内参基因表达稳定性排名并不完全相同，因此，用单一的算法来评估候选内参基因表达稳定性是片面的。为了获得更全面的结果，我们在本研究选择了3 种独立的内参基因评估方法：geNorm、NormFinder 和Best-Keeper。例如，与预期一致，在所有骨骼肌样本中，HPRT和TBP是geNorm 和NormFinder 算法得出的最适内参基因，而B2M是BestKeeper 算法得出的最适内参基因，这一结果表明了在这3 种算法程序之间存在一定的差异。因此，我们建议使用多个算法来评估内参基因稳定性。此外，我们将这3 种算法得出的结果整合到一起，为单个内参基因的稳定性排名分配权重，然后利用单个权重的均值统计得出一个综合排名[28]。

在本研究中，我们综合评估了不同猪种骨骼肌的最适内参基因稳定性。同时，本研究也存在一定的局限性。首先，我们选择了8 个候选内参基因来进行RT-qPCR，还有一些其他常用的内参基因，如18sRNA、Hmbs和Top2b未被我们选择使用。其次，本研究的结果可能并不适用于其他组织或猪品种，需要更多的研究来验证在其他组织或猪品种中的内参基因稳定性。最后，还有一些其他的统计方法未被我们使用，如Refinder 和比较delta CT 法等，根据以往的研究，其他方法也可能获得类似的结果。

4 小结

用3种独立的分析方法分析不同猪种骨骼肌中8个候选内参基因的表达稳定性，结果表明，藏猪骨骼肌最适内参基因是HPRT，而成华猪骨骼肌最适内参基因是HPRT和ACTB。DLY猪和LY猪骨骼肌最适内参基因是RPL4，骨骼肌细胞样最适内参基因是PPIA。说明不同猪种间的最适内参基因存在一定差异。综上，本研究可为不同品种猪的骨骼肌最适内参基因的选择提供一定的参考，可为内参基因的选择提供依据，并为今后的基因表达稳定性研究提供有益的参考。