Notch 信号通路在曲安奈德治疗裸鼠血管瘤模型过程中的表达

汤明生，刘强，陈俊，汪哲民

1.深圳市龙岗中心医院普外科，广东深圳 518116；2.深圳市龙岗中心医院总务科，广东深圳 518116

血管瘤是以血管瘤内皮细胞异常增殖和大量血管增生为主要病理学特征的婴幼儿常见良性肿瘤。糖皮质激素可治疗婴幼儿血管瘤，但激素治疗血管瘤的机理目前并不十分清楚，报道的临床效果也差别很大[1]。本研究通过分子水平检测曲安奈德干预裸鼠血管瘤模型过程中糖皮质激素受体亚型糖皮质激素受体α（glucocorticoid receptorα, GRα）、Notch 信号通路亚型Notch1 以及表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGRF）和Split 多毛增强子（hairy and enhancer of split, HES1）蛋白水平，选取2022 年12 月—2023 年6 月深圳市龙岗中心医院18 只小鼠为研究对象，探讨糖皮质激素治疗血管瘤敏感性的关系，特别探讨细胞增殖分化的Notch 信号通路在激素治疗血管瘤过程中的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

Balb/c nude 裸鼠[许可证号：SCXK（苏）2018-0008）]，18 只，雌性，4 周龄。普通饲料饲养于温度20～26℃，湿度40%～70%的环境中。

1.2 试剂与仪器

小鼠血管内皮瘤（murine haemangioendothelioma, EOMA）细胞（BNCC228091），曲安奈德（KD2216） ， DH5α/Stbl3 （CS01010/CS05010） ，2xGPV8PCRMasterMix（PE06010，通用生物），胎牛血清（26050070），DMEM（11965118）， 牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）（A8020）。所使用抗体：小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体（mouse anti-GAPDH），辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体（HRP conjugated goat anti-mouse IgG ）（H+L），兔抗GRα 抗体（rabbit anti GRα），兔抗Notch1 抗体（rabbit anti Notch1），兔抗HES1 抗体（rabbit anti HES1），兔抗EGFR 抗体（rabbit anti EGFR），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 抗体（HRP conjugated goat anti-rabbit IgG）（H+L）。

PCR 仪（A100）；细胞培养箱（3111），倒置生物显微镜（MF52-N）；全自动酶标仪（SuPerMax 3100），全自动化学发光图像分析系统（Tanon-5200）。普通PCR 扩增仪（TC-EA），荧光PCR 仪（CFX Connect™实时）；石蜡包埋机（HistoCore Arcadia）。

1.3 方法

1.3.1 血管瘤模型构建 动物适应性饲养约7 d 后，细胞房收集小鼠血管内皮瘤细胞EOMA，重悬为5×107个/mL 的细胞悬液。麻醉后绑定裸鼠，碘伏消毒裸鼠右侧背部区域注射EOMA 细胞，轻轻吹打混匀细胞悬液，1 mL 注射器吸取0.1 mL 细胞悬液，于裸鼠右侧背部皮下进针，皮下潜行5 mm 左右至裸鼠右侧背部近腋下位置，注射细胞悬液0.1 mL，即每只裸鼠接种5×106个细胞，注射完成旋转退针，棉棒按压针孔至无液体流出。

1.3.2 分组及处理 瘤体体积长至约100 mm 时随机分3 组，分别为Control 组、Control+TA for 7 days 处理组、Control+TA for 14 days 处理组，每组6 只，按分组同时给予相应药物处理。曲安奈德处理组向瘤体内注射曲安奈德（triamcinolone acetonide, TA）注射液9.01 mg/kg；Control 组（对照组）瘤体内注射等量生理盐水，给予1 次。每3 d 记录瘤体颜色及肿瘤生长情况。在给予曲安奈德注射后第7、14 天每组随机处死3 只小鼠，取血管瘤组织分别提取RNA 和蛋白，行WB 和qPCR 检测GRα、Notch1、Hes1、EGFR。剩余每组对3 只小鼠血管瘤细胞做免疫组化检测GRα、Notch1、Hes1、EGFR 的表达。

1.4 观察指标

①检测小鼠体重及瘤体体积改变。

②WB 实验。取肿瘤组织，弃去培养基，用RIPA 裂解液提取总蛋白。12 000 r/min 高速离心机4℃离心10 min，取上清液，BCA 蛋白定量试剂盒对总蛋白进行定量。对蛋白样品进行变性后，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE），后用300 mA 恒流转膜1.5 h。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜用脱脂奶粉封闭后，一抗4℃孵育过夜，次日PVDF 膜室温孵育二抗2 h，用发光液浸湿PVDF 膜，置于超高灵敏度化学发光成像系统中进行显影。所使用的抗体及对应稀释倍数见表1。

表1 抗体名称及稀释倍数

③实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）实验。采用Trizon 试剂提取细胞中的总RNA，采用RNA 超纯提取试剂盒提取mRNA，利用紫外可见分光光度计测定mRNA 的浓度和纯度（OD260/OD280），通过RNA 逆转录试剂盒合成cDNA，采用荧光PCR 仪进行荧光定量PCR。反应步骤如下：预变性95℃，10 min；变性95℃，10 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，30 s；40 个循环。引物序列见表2。

表2 引物序列

④免疫组化。采用免疫组化检测GRα、Notch1、Hes1、EGFR 的蛋白表达水平。肿瘤组织切片，烤片、脱蜡、水化后，用柠檬酸缓冲液进行抗原修复。经5%BSA 抗原封闭后，用兔抗GRα 抗体（1:200），兔抗Notch1 抗体（1:200），兔抗Hes1 抗体（1:100），兔抗EGFR 抗体（1:100），辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1:100）孵育，经DAB 显色，苏木素复染反蓝，脱水透明后，封片，在显微镜下观察。

1.5 统计方法

应用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较应用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组小鼠肿瘤体积及体重变化对比

与Control 组相比，其余两组的体重显著下降，Control+TA for 7 days 处理组中，肿瘤体积下降最明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 3 组小鼠体重（A）与肿瘤体积（B）变化对比

2.2 3 组小鼠WB 检测肿瘤组织中蛋白表达情况对比

与Control 组相比，Control+TA for 7 days 处理组和Control+TA for 14 days 处理组中GRα、Notch1 和EGFR 蛋白表达显著下降，而HES1 蛋白显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 3 组小鼠肿瘤组织中蛋白表达情况对比

2.3 3 组小鼠肿瘤组织中GRα、Notch1、Hes1 和EGFR 的mRNA 表达情况对比（qPCR）

与Control 组相比，Control+TA for 7 days 处理组和Control+TA for 14 days 处理组中GRα、Notch1 和HES1 蛋白表达显著下降，而EGFR 蛋白显著上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 3 组小鼠肿瘤组织中GRα、Notch1、Hes1 和EGFR 的mRNA 表达情况对比

2.4 3 组小鼠肿瘤组织中GRα、Notch1、Hes1 和EGFR 表达情况对比（免疫组化）

与Control 相比，Control+TA for 7 days 处理组化和Control+TA for 14 days 处理组中GRα、Notch1、HES1 蛋白和EGFR 阳性细胞减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 3 组小鼠肿瘤组织中GRα、Notch1、Hes1 和EGFR 表达情况对比

3 讨论

糖皮质激素治疗能有效抑制血管瘤生长，促进其消退，且瘤内注射糖皮质激素较少出现因治疗所致的严重容貌损害，有简单易行、不良反应少、见效较快等特点[2]。有研究结果已说明糖皮质激素受体是介导糖皮质激素作用的关键因素[3]。GRα 是糖皮质激素受体的亚型。Notch 受体亚型中存在含有糖皮质激素反应元件，且是参与增殖发育功能的基因。哺乳动物中存在4 种Notch 基因，即Notch1～4。研究表明Notch 信号通路在血管的发育与稳定中起着关键作用[4-6]。本研究在前期对人体的血管瘤组织进行糖皮质激素治疗敏感性研究的基础上，通过应用血管瘤动物模型，探讨了糖皮质激素治疗前后糖皮质激素受体以及Notch 信号通路关键因子的变化的关系，并进一步探究糖皮质激素治疗血管瘤敏感性及其机理。本研究首次反映细胞增殖分化的Notch 信号通路应用于激素治疗血管瘤组织中糖皮质激素受体及其亚型的表达与激素治疗敏感性关系的研究。

本研究结果中：WB 实验结果显示，与Control 组相比，Control+TA for 7 days 处理组和Control+TA for 14 days 处理组中GRα、Notch1 和EGFR 蛋白表达显著下降，而HES1 蛋白显著上升（P＜0.05）；qPCR 实验结果显示，与对照组相比，Control+TA for 7 days 处理组和Control+TA for 14 days 处理组中GRα、Notch1 和HES1 蛋白表达显著下降，而EGFR 蛋白显著上升（P＜0.05）；免疫组化结果显示，与Control 组相比，Control+TA for 7 days 处理组免疫组化和Control+TA for 14 days 处理组中GRα、Notch1、HES1 和EGFR 阳性细胞减少，表明曲安奈德可使裸鼠模型血管瘤组织GRα、Notch1 表达明显下降（P＜0.05）。

综上所述，Notch 信号通路参与了曲安奈德治疗血管瘤的作用过程。为认识婴幼儿血管瘤发病机制及治疗方法的选择提供了新的视角。