足底注射完全弗氏佐剂致疼痛抑郁共病模型大鼠行为学及单胺类神经递质改变

羊璞粟胜勇王甜苏虹

(1. 广西中医药大学第一临床医学院,南宁 530023;2. 广西中医药大学第一附属医院针灸科,南宁 530023;3. 广西中医药防治医学分子生物重点实验室,南宁 530023)

慢性疼痛是指疼痛持续或间歇性超过12 周,在此过程中,慢性疼痛作为一种长期的应激源常导致患者出现抑郁状态[1]。 慢性疼痛和抑郁可相互叠加,造成患者功能下降,并影响预后,增加治疗费用[2]。 疼痛和抑郁的共病可导致临床诊断产生误差,可能会造成治疗时机的延误,从而进一步增加患者负担。 临床上慢性炎性疼痛常与抑郁共存[3],但目前慢性炎性疼痛和抑郁发生的因果关系及内在机制尚不清楚,因此,建立合理、可靠、易得的动物模型是进一步研究二者关系的基础[4]。 基于单胺类神经递质假说研发的临床药物,如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、5-羟色胺去甲肾上腺素再摄取抑制剂,已被证实对疼痛抑郁共病具有疗效,显示出单胺类神经递质在慢性疼痛和抑郁共病中的关键作用[5]。 单胺类神经递质作用分别在疼痛和抑郁中的较多,但涉及慢性炎性疼痛抑郁共病的研究还较为少见,因此本实验拟通过完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)建立慢性炎性疼痛抑郁共病模型大鼠,观察模型大鼠疼痛、抑郁样行为学及海马单胺类神经递质的变化,为慢性炎性疼痛抑郁共病的基础研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

8 周龄SPF 级健康SD 雄性大鼠16 只,体重为180 ~ 220 g,购自长沙市天勤生物技术有限公司【SCXK(湘)2019-0014】,饲养于广西中医药大学第一附属医院医学分子生物学实验室动物房【SYXK(桂)2019-0001】,饲养温度23 ~ 25℃,相对湿度50% ~ 60%,12 h/12 h 昼夜节律,自由饮水摄食。本实验所有操作符合动物福利伦理原则,并通过广西中医药大学实验动物福利伦理委员会的批准(DW20220523-106)。

1.1.2 主要试剂与仪器

苏木素染色液、伊红染色液(批号:BA-4041,BA-4024,珠海贝索生物技术有限公司);分化液(批号:C0163M,上海碧云天生物技术有限公司);5-HT、 DA、 NE (批号: E-EL-0033c, E-EL-0046c,E-EL-0047c, 武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA),(批号:7009,美国Sigma-Aldrich 公司);异氟醚(批号:R510-22,深圳瑞沃德生命科技有限公司)。 40 cm × 23 cm × 15 cm 聚丙烯透明树脂材料敞箱、48 cm × 34 cm × 39 cm 足底测试平台、Von Frey 纤维丝(型号:NC12775-79,购自上海玉研科学仪器有限公司); 小动物专用麻醉机(型号:CDS9000,美国Harvard);热板痛觉测试仪(型号:ⅡTC39, 美国Life Science);自动多功能酶标仪(型号:BioTek-Elx800,美国Thermo Fisher)。

1.2 方法

1.2.1 分组和造模

慢性炎性疼痛抑郁共病大鼠模型造模方法:参考文献[6-9]的方法,大鼠用2%异氟醚吸入麻醉后,俯卧位固定,使用微量注射器给予大鼠左后爪足底表面注射CFA 100 μL,造模48 h 后,大鼠造模足出现明显红肿现象且痛阈值明显下降,代表造模成功。 对照组注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)

根据改良Up-down 法计算MWT[10],将大鼠放置于金属筛网上的聚丙烯树脂材料敞箱内,安静15 min 后,以一系列标准化Von Frey 纤维丝垂直刺其左后肢足底中部皮肤,缓慢增加压力使纤维丝呈现“C”或“S”型,并保持6 ~ 8 s,大鼠出现抬足、舔足、躲避等反应时被视为阳性反应。 使用公式MWT =(10[Xf+kδ])/10000 计算具体数值,其中Xf 为最后一支Von Frey 丝的压力值;k 为阳性反应组合相对应的查表值,δ 为所用刺激间的平均差值(0.224)。

1.2.3 热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal lantency,TWL)

将大鼠置入有机玻璃箱中盖上挡板使其适应15 min,后用热板痛觉刺激仪照射大鼠足底,照射开始至大鼠出现抬腿回避时间为热缩足反射潜伏期。同一刺激部位刺激的间隔时间为10 min,记录时间,每只大鼠连续测定3 次取平均值。

1.2.4 旷场实验(open-field test,OFT)

有相关调查研究表明，动物及其产品质量的高低，与动物的健康状况有密切的联系，与我国疫病控制的效果有较大的关联。加强对动物疫病的监测，一方面能降低动物发生疫病的概率；另一方面还能促使动物的生产以及养殖过程得到控制，进而提升动物及其产品的质量。开展动物疫病监测工作，能保证安全的动物及其产品进入到市场，使人们都能吃到放心的产品。如对于牛羊布鲁氏等一些隐性的病菌，寻常的检测手段难以发觉，但是通过动物疫病监测以及对采样的方式，能及时发现其血液中所存在的病害，警醒防疫机构，使其提前做好防疫准备，并及时制止该肉制品流入到市场，有效保护了人们群众的人身安全。

将大鼠放置于黑色敞箱(50 cm × 50 cm × 40 cm)底部中心方格内适应15 min,设中心点附近20 cm ×20 cm 方形区域为中央区,进行摄像和计时,记录每只大鼠5 min 的运动总距离和中央区停留时间,两只大鼠实验之间用75%乙醇清洁旷场箱底部及四壁。

1.2.5 悬尾实验(tail suspension test,TST)

使用医用胶布将大鼠尾部距末端约1/3 处缠绕固定于悬尾仪上,使大鼠呈倒挂状态,采用摄像头观察并记录大鼠在5 min 内的不动时间。

1.2.6 强迫游泳实验(forced swim test,FST)

将大鼠放入无盖、透明的有机玻璃圆桶中,水深约30 cm,水温(20 ± 2)℃,记录5 min 内大鼠累计不动时间(以四肢偶尔微小滑动保持头部浮在水面露出鼻孔保持呼吸为“不动”标准),每只大鼠实验后即换水并将大鼠擦干。

以上行为学实验分别于造模前1 d,造模后3、7、14 d 进行。

1.2.7 单胺类神经递质测定

所有行为学实验完成24 h 后,大鼠麻醉后开胸,暴露心脏,使用0.9%氯化钠溶液灌注,待血液流尽后离断头部剥离出大脑组织。 4℃蒸馏水冲洗干净后置于培养皿中,于冰上分离大脑,参照Paxinos-Watson 大鼠脑立体定位图谱取海马,钝性分离出两侧大脑海马组织,放入液氮中速冻后于-80℃冰箱保存备用。 具体参照文献[11-12]的方法,取两组大鼠海马组织于4℃下2000 r/min 离心10 min,收集上清液,检测5-HT、DA、NE 的含量,按ELISA 试剂盒说明书的操作步骤进行。

1.2.8 海马组织病理变化

海马取材方法同上,海马组织常规石蜡包埋后切片,厚度5 μm,脱蜡水洗后,HE 染色,光学显微镜观察海马组织形态变化。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0 软件进行统计分析。 所有数据采用平均值± 标准差(±s)表示,数据符合正态分布且方差齐,多个时间点测量的结局比较采用重复测量方差分析,其余资料采用t检验比较组间差异,以P< 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠疼痛行为学比较

造模前1 d,两组大鼠的MWT 与TWL 对比,无统计学意义(P> 0.05)。 造模后,模型组大鼠造模3、7、14 d 的MWT 与TWL 均明显降低,有统计学意义(P< 0.01),表明CFA 足底注射造模可快速造成大鼠对机械痛敏和热痛敏的敏感性增加。 见图1。

图1 两组大鼠MWT 及TWL 比较Note. Compared with control group, **P < 0.01. (The same in the following figures)Figure 1 Comparison of MWT and TWL of rats in two group

2.2 大鼠抑郁样行为学比较

造模前1 d 及造模3 d,两组大鼠OFT 运动总距离、中央区停留时间对比无统计学意义(P> 0.05),造模后,模型组大鼠在造模7、14 d 的OFT 运动总距离低于对照组,有统计学意义(P< 0.01);模型组大鼠在造模7 d 的OFT 中央区停留时间与对照组对比无统计学意义(P> 0.05),但在14 d 的OFT 中央区停留时间低于对照组(P< 0.01);造模前1 d 及造模3 d,两组大鼠的TST、FST 不动时间无统计学意义(P> 0.05),模型组大鼠在造模14 d 的TST 不动时间高于对照组,有统计学意义(P< 0.01),造模7 d 时,TST 不动时间无统计学意义(P> 0.05);模型组大鼠在造模7、14 d 的FST 不动时间增加,有统计学意义(P< 0.05,P< 0.01),说明CFA 造模7 d后即可出现部分绝望行为,在14 d 时症状更明显。见图2。

图2 两组大鼠OFT、TST、FST 指标比较Note. Compared with control group, *P < 0.05.Figure 2 Comparison of OFT, TST and FST of rats between the two groups

2.3 大鼠海马单胺类神经递质含量比较

与对照组相比,模型组大鼠海马5-HT、DA、NE含量均显著降低,具有统计学意义(P< 0.01),可以认为CFA 足底注射14 d 后可导致大鼠海马单胺类神经递质表达下降。 见图3。

图3 两组大鼠海马单胺类神经递质含量比较Figure 3 Comparison of monoamine neurotransmitters in hippocampus of rats between the two groups

2.4 大鼠海马组织病理形态变化

对照组神经元排列整齐,结构完整,形态规则,染色清晰,细胞间隙均匀;模型组神经元形态不规则,排列松散、紊乱,细胞间隙增大,部分细胞核模糊,出现部分神经元固缩、凋亡。 见图4。

图4 大鼠海马区病理形态改变Note. Black arrows. Normal cells. Red arrow. Unclear cell nuclei. Yellow arrow. Intercellular space. Blue arrow. Neuronal contraction and apoptosis.Figure 4 Pathological changes in the hippocampus of rats

3 讨论

临床中众多炎性疼痛疾病与抑郁具有高度共患性,如膝骨关节炎、类风湿关节炎、慢性盆腔炎[3,13-14],早期证据表明,神经突触间隙单胺递质的浓度的高低影响了慢性疼痛与抑郁障碍的发生发展[1],研究显示脑内单胺类神经递质失衡是疼痛抑郁共病的重要机制之一,针对海马单胺类神经递质探讨慢性疼痛抑郁共病的发病机制具有显著意义[15]。 近年疼痛抑郁共病研究数量急剧增加,显示出研究人员对这两种疾病共病状态的高度关注,建立相关共病的动物模型有助于进一步探索二者之间关系,并有助于新治疗方式的开发。 近年慢性疼痛抑郁共病造模方法众多,可通过神经病理性疼痛及炎症性疼痛诱导[16],也有研究通过腹腔注射利血平快速诱导,各种造模方法产生的疼痛及其诱导的抑郁具有差异,且各有优劣,选用适合的造模方法是研究方案制定的前提和基础[15,17]。

CFA 是一种含有灭活的结核分枝杆菌的油包水乳剂,能够提供刺激性强且持久的免疫反应所需的抗原释放,在足底或胫骨关节内注射可制作外周慢性炎性疼痛模型[18],导致动物产生机械性痛觉异常及热痛觉过敏,单次注射后其效果至少可维持以21 d。 也有研究为确保疼痛症状的持续,在首次注射10 d 后再次注射CFA[19]。 另有实验研究选用C57/B6 小鼠,分别在第1 、7 、14 天于后足底表面3 次注射20 μL CFA,此方法适用于较长周期的动物行为学观察实验[20]。 在以往研究中,发现CFA的用量有10 ~ 100 μL 不等,大小鼠品系不同也会影响用量的多少[21]。 本研究探索性的采用足底注射CFA 100 μL 诱导大鼠慢性炎性疼痛症状,结果发现造模3 d 后大鼠的MWT 和TWL 即大幅降低,且疼痛效果持续时间可超过14 d,提示CFA 100 μL足底注射可快速诱导大鼠的机械性痛觉异常及热痛过敏,这与前期研究[22]结果一致。 疼痛感觉是相关情绪和认知功能活动的基础,慢性疼痛可导致大鼠奖赏机制缺陷和快感缺失,OFT、FST、TST 是用于评估动物行为绝望的检测方法,本研究结果显示,造模7 d 后,模型组大鼠出现OFT 运动总距离降低和FST 不动时间增多,造模14 d 后出现了OFT 运动总距离和中央区停留时长减少、FST、TST 不动时间增加,提示CFA 100 μL 注射在第7 天即可诱导出动物的部分抑郁行为,这与Wang 等[6]的研究结果基本类似。

5-HT、DA、NE 是参与情绪活动、疼痛传递的重要生化物质,浓度降低及其受体功能低下可间接导致(下丘脑-垂体-肾上腺)HPA 轴功能亢进,形成慢性疼痛或者情志改变[23],另有研究也显示在慢性疼痛和抑郁患者体内均可发现5-HT、DA、NE 水平和功能的减退。 以往研究证实CFA 导致的慢性炎性疼痛抑郁共病与炎症因子有关,但针对单胺类神经递质的研究却少有提及[24]。 因此本研究以单胺类神经递质为切入点进一步研究二者关系,结果发现,CFA 注射后可导致海马内单胺类神经递质含量降低,证实了CFA 诱导的慢性炎性疼痛及共患抑郁样行为,其机制可能与单胺类神经递质减少密切相关。

海马体作为大脑边缘系统的重要组成部分,是炎性疼痛和抑郁联系的一个关键部位[22]。 海马神经元的凋亡是介导疼痛抑郁出现的关键病理变化[25]。 本研究发现,与对照组相比,模型组大鼠海马细胞形态改变,神经元形态不规则,排列松散、紊乱,细胞间隙增大,部分细胞核模糊,出现部分神经元固缩、凋亡。 提示海马神经元损伤情况与行为学实验结果相一致。

本研究存在部分局限性:目前CFA 致疼痛抑郁的药物使用剂量不统一,未对不同梯度剂量CFA 足底注射对大鼠行为学的影响进行研究,以探索建立慢性炎性疼痛抑郁共病模型所需的合适剂量;另外本研究只进行了为期14 d 的行为学观测,研究周期相对较短,在未来研究中会继续延长观察周期,为后续干预措施选择合理的介入时机提供参考。