现制红茶奶茶开封后微生物动态变化规律初探

苏小琴，宋鹏鹏，孔俊豪*，左小博，杨秀芳，陈根生

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究所，浙江杭州 310016；2.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州 310016；3.中国农业科学院茶叶研究所，浙江杭州 310008）

现制茶饮是以茶叶为基底原料， 通过不同萃取方式现场提取茶汤， 再加入奶制品或水果等原辅料调制并销售的茶饮料，是继传统杯泡热饮、工业化瓶装即饮茶之后的第三大茶叶消费方式[1-4]。据统计，2020 年我国茶叶贸易中传统冲泡茶、即饮茶和现制茶饮的占比依次为43.1%、29.2%和27.7%，现制茶饮消耗超过20 万吨茶叶原料，逐渐成为解决传统茶业产大于销困境的重要路径[5-7]。

现制奶茶是茶叶经现场水浸提取，加入一种或多种乳、乳制品、植物蛋白、植脂末，配以果葡糖浆或其他辅料，经混合、摇茶等工序制成，保持茶和奶风味的现制现售液体饮料[8-9]。 因其独特的口感风味和营养特性，成为消费者喜爱的现制茶饮主导品类之一[10-11]。 然而，因其营养物质丰富，如果在制作、饮用过程中操作不规范，易造成微生物污染[12-14]。刘洋等[15]对中小型冷饮店及家庭自制的饮料菌落总数、 霉菌和酵母菌进行测定，发现鲜榨果汁及手工调制饮料容易受到微生物污染， 且滋生微生物的数量和种类与饮料类型、制作环境等密切相关。 杨露等[16]研究表明配料中食用冰块是市售奶茶中细菌的重要来源，且春夏秋季节样品微生物含量显著高于冬季样品。 目前，现制奶茶微生物的研究主要集中于市售奶茶抽样检测，针对市售奶茶开封后微生物的动态变化研究尚未见报道。

文章以现制市售热和加冰红茶奶茶为研究对象，开封后置于常温（25 ℃）、自然湿度条件下贮存6 h， 研究红茶奶茶微生物的动态变化规律，为现制茶饮茶基底和现制奶茶的品质与卫生质量控制提供理论依据， 为消费者科学饮用现制奶茶提供指导， 以期促进现制茶饮行业的健康可持续发展。

1 材料和方法

1.1 实验材料

现制红茶奶茶： 选取三个不同价位的奶茶品牌， 分别购买现制加冰和热红茶奶茶两种类型奶茶，每种奶茶购买三杯作为平行，具体信息见表1。

表1 奶茶类型及编号Table 1 Milk tea type and number

1.2 培养基和试剂

平板计数琼脂培养基（PCA）、孟加拉红培养基（RBM）、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）、结晶紫中性红胆盐琼脂 （VRBA） 和煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）均购于青岛海博生物有限公司，无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司， 氯化钠购于阿拉丁公司，磷酸盐缓冲液，无菌生理盐水等其它试剂由实验室配制。

1.3 仪器设备

FA2004 型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；立式高压蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SW-CJ-IF 型无菌超净工作台（苏州净化设备有限公司）；SPX-150B-Z 型恒温培养箱 （上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；PHSJ-4F 实验室pH 计 （上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 奶茶样品处理

将不同品牌加冰和热红茶奶茶开封后， 置于温度25 ℃， 自然湿度条件下的恒温培养箱中存放，分别在0、0.5、1、2、4 和6 h 吸取5 mL 至无菌试管中，重复取样三次，用于菌落总数、霉菌、酵母菌和大肠菌群测定。

1.4.2 奶茶微生物含量的测定

依据GB 4789.2—2022 《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》 和GB 4789.15—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》 分别对茶基底及奶茶进行菌落总数、 霉菌和酵母菌含量测定。 依据GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠菌群计数》第二法-大肠菌群平板计数法进行奶茶大肠菌群含量测定。

1.5 数据处理

采用Microsoft Excel 2019 进行数据处理，软件SPSS20.0 进行数据分析及皮尔森相关系数分析，使用OriginPro 9.0.0 软件制图。

2 结果与分析

2.1 现制红茶奶茶霉菌动态变化分析

将加冰和热红茶奶茶开封后，置于25 ℃恒温培养箱，分别测定0、0.5、1、2、4 和6 h 时奶茶中霉菌的含量，结果见图1。 由图1a 可知，加冰红茶奶茶MT1 开封后6 h 期间均未检出霉菌，MT3 与MT5 红茶奶茶存放6 h 时， 霉菌含量分别为15 CFU/mL 和2 CFU/mL。与第0 h 比，MT3 霉菌含量显著性增长（p<0.05）。 由图1b 可知，热红茶奶茶MT2、MT4、MT6 开封后存放6 h 期间均未检出霉菌。 热红茶奶茶和加冰红茶奶茶开封后霉菌含量变化较小， 这可能与制备红茶奶茶的茶基底原料微生物情况和制作的规范性有关[17-19]。

图1 现制红茶奶茶中霉菌的变化趋势Fig.1 The trend of mold infreshly made black milk tea

2.2 现制红茶奶茶酵母菌动态变化分析

市售加冰和热红茶奶茶开封后酵母菌含量变化结果见图2。 由图2a 可知，第0 h，加冰红茶奶茶MT1、MT3、MT5 酵母菌含量分别为9.1×102、50、0 CFU/mL， 开封放置0.5 h， 加冰红茶奶茶MT3、MT5 酵母菌含量显著增长（p<0.05），放置6 h 时加冰红茶奶茶MT1、MT3、MT5 样品酵母菌含量分别为2.8×103、1.2×102、1.3×102CFU/mL， 其中MT1 酵母菌含量最高，是刚开封时的3 倍，MT5 样品初始未检出酵母菌， 但放置6 h 时MT5 样品酵母菌含量与MT3 样品接近，这可能与红茶奶茶中牛奶和糖等配方以及奶茶店操作环境中含有的酵母菌相关[20-21]。而热红茶奶茶MT2、MT4、MT6 样品开封放置6 h 期间均未检出酵母菌（图2b）。 这可能由于热红茶奶茶制备时使用沸水冲泡， 对酵母菌起到一定灭菌作用[22-23]。

图2 现制红茶奶茶中酵母菌变化趋势Fig.2 The trend of yeast in freshly made black milk tea

2.3 现制红茶奶茶大肠菌群动态变化分析

红茶奶茶开封后大肠菌群含量变化结果见图3。由图3a 可知，第0 h，加冰红茶奶茶MT1、MT3、MT5 大肠菌群含量分别为6.4×104、0、4.5×104CFU/mL， 这种差异可能和茶基底以及操作人员、机器、环境有关[17]。 开封放置0.5 h 加冰红茶奶茶大肠菌群含量均未出现显著增长（p＞0.05），放置6 h 加冰红茶奶茶大肠菌群含量均显著增长 （p<0.05），MT1、MT5 大肠菌群含量分别为1.4×105、7.1×104CFU/mL，其中MT3 初始未检出大肠菌群，放置6 h 时大肠菌群含量3.0×102CFU/mL， 这可能与辅料中的冰块以及奶茶店操作人员及设备中的大肠菌群相关[24-25]。 由图3b 可知，热红茶奶茶MT2 放置6 h 期间均未检出大肠菌群，MT4 和MT6 热红茶奶茶第0 h 大肠菌群含量分别为4.7×104、0 CFU/mL， 开封放置0.5 h 热红茶奶茶MT4大肠菌群含量显著增长 （p<0.05）， 放置1 h 时，MT4 和MT6 大肠菌群含量均显著增长（p<0.05），放置6 h 时，MT4 和MT6 大肠菌群含量分别达9.9×104、2.6×104CFU/mL。

图3 现制红茶奶茶中大肠菌群变化趋势Fig.3 The trend of coliform bacteria in freshly made black milk tea

2.4 现制红茶奶茶菌落总数动态变化分析

市售加冰和热红茶奶茶开封后菌落总数的变化结果见图4。 由图4a 可知，加冰红茶奶茶MT1、MT3、MT5 第0 h 菌落总数含量分别为2.1×104、3.4×104、1.6×104CFU/mL。 与第0 h 比， 开封放置0.5 h 加冰红茶奶茶MT1 菌落总数显著增长 （p<0.05）， 放置1 h 加冰红茶奶茶菌落总数含量均出现显著增长（p<0.05），放置6 h 后，MT1、MT3、MT5菌落总数分别为2.7×105、7.7×104、6.4×104CFU/mL。 热红茶奶茶MT2、MT4 第0 h 菌落总数含量分别为7.0×103、1.2×104CFU/mL， 开封放置0.5 h热红茶奶茶MT2 菌落总数出现显著增长 （p<0.05）， 开封放置1 h 热红茶奶茶MT2 和MT4 菌落总数含量均显著增长（p<0.05），放置6 h 后菌落总数分别为1.5×105、1.6×105CFU/mL，而热红茶奶茶MT6 放置6 h 期间均未检出菌落总数。

图4 现制红茶奶茶中菌落总数变化趋势Fig.4 The trend of total number of colonies in freshly made black milk tea

2.5 相关性分析

采用皮尔森系数分析放置不同时间微生物含量的相关性， 对于现制红茶奶茶放置0、0.5、1、2、4和6 h 时奶茶中霉菌、酵母菌、大肠菌群含量和菌落总数分别计算皮尔森相关系数，结果见表2。 由表2可知， 放置0 h 与1 h 现制红茶奶茶的霉菌含量为极显著正相关（p<0.01），放置0 h 与0.5、1、2、4 和6 h 现制红茶奶茶的酵母菌和大肠菌群含量分别为极显著正相关（p<0.01），放置1 h 与2 h、4 h 的现制红茶奶茶菌落总数为极显著正相关（p<0.01），放置0 h与0.5 h，0.5 h 与2 h，1 h 与6 h 现制红茶奶茶菌落总数为显著正相关（p<0.05）。 由此可见，现制红茶奶茶开封放置6 h，酵母菌、大肠菌群和菌落总数含量与初始奶茶中微生物含量显著相关（p<0.05）。

3 讨论

以市售现制加冰和热红茶奶茶为研究对象，在常温（25 ℃），自然湿度条件下放置0、0.5、1、2、4和6 h，按照国标方法测定霉菌、酵母菌，大肠菌群和菌落总数。 结果显示，第0 h，现制加冰红茶奶茶霉菌含量较低，含量为0~1 CFU/mL，酵母菌、大肠菌群和菌落总数含量分别为0~9.1×102CFU/mL、0~6.4×104CFU/mL 和1.6×104~3.4×104CFU/mL。 加冰红茶奶茶在25 ℃条件下放置6 h， 霉菌含量范围0~15 CFU/mL，与第0 h 比，加冰红茶奶茶酵母菌、大肠菌群、菌落总数显著增长（p<0.05），含量范围分别为1.2×102~2.8×103CFU/mL、3.0×102~1.4×105CFU/mL、6.4×104~2.7×105CFU/mL。热红茶奶茶开封6 h 期间，均未检出霉菌和酵母菌。 与第0 h比，热红茶奶茶MT2、MT4 开封放置6 h，大肠菌群和菌落总数显著增长 （p< 0.05）， 而热红茶奶茶MT6 大肠菌群和菌落总数均未检出。 与第0 h 比，加冰红茶奶茶 （MT1、MT3、MT5） 和热红茶奶茶（MT2、MT4） 放置6 h 菌落总数均显著增加 （p<0.05）。皮尔森相关性分析表明，现制红茶奶茶开封6 h 期间，酵母菌、大肠菌群和菌落总数含量与初始红茶奶茶中微生物含量显著相关（p<0.05）。

综上， 现制红茶奶茶开封放置过程中菌落总数和大肠菌群呈增加趋势， 加冰红茶奶茶微生物含量普遍高于热红茶奶茶， 表明现制奶茶微生物情况与茶基底原料、 冰块等原辅料卫生以及操作规范环境等相关[26-29]。 因此，建议消费者选择卫生环境较好的奶茶店， 开封后尽快饮用完毕。 下一步， 将对茶基底原料与现制奶茶微生物含量的变量关系进行深入研究， 同时加强现制茶饮制作过程中对于“料、人、机、环”的有效控制和严格管理，保障现制茶饮的品质与安全， 满足现代消费者对现制茶饮的高品质需求。