基于人工智能的细胞形态学分析在白细胞分类中的临床应用

邱 实, 宋鹏飞, 常志红, 夏迎龙, 张立新, 李 然,连思博, 王懿馨, 刘 杰, 2

(1. 中国人民解放军总医院第七医学中心 检验科, 北京, 100700;2. 南方医科大学 第二临床医学院 广东 广州, 510280)

血细胞形态学检查包括对外周血白细胞(WBC)的计数和形态学的分析,目前仍是临床上血液系统疾病和非血液系统疾病基础诊断与常规血液学检验的重要项目,是最基本、最简便实用的检查方法[1-3]。目前,血细胞计数已经摆脱了传统手工操作、显微镜下检查的方式,可以由自动血液分析仪完成[4]。但血细胞分析仪尚不具备识别红细胞、白细胞、血小板形态的能力,无法完全替代显微镜对血细胞的识别和分类检查[5]。细胞学家、数学家和工程师之间的密切合作,促进了正常血细胞数字图像处理自动工具的发展[6-7]。目前,市面上主流的全自动血细胞数字化分析仪DM/DI系列,如全自动细胞形态学分析仪采用人工智能(AI)神经网络系统对WBC进行分类。为了进一步评估全自动细胞形态学分析仪对外周血WBC预分类的能力,并探讨全自动血细胞形态学数字图像分析在WBC形态学检查中的临床应用价值,本研究以手工计数结果为标准参考,比较了目前国内医院检验科常用的全自动血液分析仪,对全自动细胞形态学分析仪计数法的临床计数结果进行比较研究,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机收集2023年1—5月中国人民解放军总医院第七医学中心住院和门诊患者的乙二胺四乙酸二钾抗凝静脉血标本306份,其中感染性疾病患者15例,实体肿瘤患者18例,血液病患者20例,其他疾病患者54例,健康体检者199例; 男162例(52.9%), 平均年龄(39.4±20.8)岁; 女144例(47.1%), 平均年龄(35.5±18.6)岁。本研究获得中国人民解放军总医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 主要仪器与试剂

全自动血液分析仪xn-20(日本希森美康公司),全自动血液分析仪xn-10(日本希森美康公司),全自动细胞形态学分析仪SP-10(日本希森美康公司),全自动细胞形态学分析仪DI-60(日本希森美康公司), CX23光学显微镜(日本奥林巴斯公司),瑞氏-吉姆萨染色液(美国Sigma-Aldrich公司)。

1.3 全自动细胞形态学分析仪计数

血液采集后4 h内,采用全自动细胞形态学分析仪SP-10自动推片染色仪制备外周血涂片,并应用全自动血细胞分析仪对200个WBC进行自动分析,采用人工智能神经网络系统将WBC分为19类,包括中性杆状核粒细胞、中性分叶核粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性早幼粒细胞、中性中幼粒细胞、中性晚幼粒细胞、幼稚嗜酸粒细胞、幼稚嗜碱粒细胞、幼稚单核细胞、幼稚淋巴细胞、原始细胞、异型淋巴细胞、浆细胞、大颗粒淋巴细胞、毛细胞、赛塞利细胞。白细胞分析工作步骤为: 根据巴特曼形式对白细胞层进行扫描,即从血涂片细胞层较厚一侧固定位置开始搜索单细胞层并定位; 自动转换到100倍物镜,系统开始抓取细胞图像; 获得专利的自动对焦技术(使用人工智能预测方向和距离呈现出一张最佳对焦的图像,该过程只需1～3张图像)进行自动对焦; 当细胞被对焦后,即对细胞特性进行切分(放大100倍),对360种以上的特性进行分析; 进行细胞预分类(人工智能神经网络系统),向细胞层较薄一侧逐一扫描,在10倍镜下抓取图像,直到确定单细胞层起止点; 最后保存细胞图像及数字扫描区域图像。

1.4 全自动血液分析仪计数

对所有样本采用全自动血液分析仪xn-20/xn-10进行WBC计数分析。严格按照仪器标准操作规程进行日常操作,开机维护后,检测其质控结果,若有失控情况及时处理,各项质控均在控后,作为常规标本将实验标本进行检测,并记录其WBC结果。需要说明的是,全自动血细胞分析仪仅能识别WBC 5个种类: 粒细胞(一般默认是中性分叶核细胞)、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。

1.5 手工计数法

由3位形态学专家根据《WS/T246-2005白细胞分类参考方法》[8]对所有标本进行WBC手工计数,即先由第1位专家和第2位专家对每个标本的2张血涂片分别镜检,并对200个白细胞进行分类,当2位专家结果超出95%置信区间时,再由第3位更资深的专家选取第3张血涂片进行确认,输出最终的人工镜检结果。评估专家审核后的WBC分类结果与人工显微镜镜检结果的相关性。上述19类WBC种类手工计数法均可识别。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 全自动细胞形态学分析仪、全自动血液分析仪和手工计数法对白细胞预分类结果的比较

采用全自动细胞形态学分析仪、全自动血液分析仪和手工计数法共3种方法对白细胞进行预分类,全自动细胞形态学分析仪识别的白细胞种类最多,原则上可识别白细胞种类共19类; 本研究统计的血液样本识别结果显示,全自动细胞形态学分析仪共识别出12类白细胞种类,除了识别出的6类成熟WBC(中性杆状核粒细胞、中性分叶核粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)外,也可识别各阶段幼稚粒细胞和异常细胞共6类; 其中原始细胞、浆细胞只有全自动细胞形态学分析仪检出。手工计数法共识别出白细胞种类11类。全自动血细胞分析仪识别出的白细胞种类最少,共7类。3种方法均能识别出的白细胞种类共7类,包括5类成熟WBC、异型淋巴细胞和中性早幼粒细胞。见图1。

图1 3种方法对白细胞预分类的结果比较

全自动细胞形态学分析仪与手工计数法比较的配对卡方检验结果显示χ2=0,P>0.999, 提示2种方法对WBC预分类种类比较不存在差异; 一致性检验显示Kappa=0.67,P=0.000 1, 提示2种方法诊断结果具有中等一致性。全自动细胞形态学分析仪与全自动血细胞分析仪比较的配对卡方检验结果提示2种方法存在差异(χ2=5.14,P=0.02), 2种方法诊断结果存在较差一致性(Kappa=0.34,P=0.02)。上述结果表明全自动细胞形态学分析仪识别白细胞种类的能力较好。

2.2 全自动细胞形态学分析仪、全自动血液分析仪和手工计数法计数结果比较

对3种方法计数WBC结果进行比较分析, 3组配对样本Wilcoxon检验结果显示,除了中性早幼粒细胞外,其他白细胞分类在3种方法间存在差异,其中全自动细胞形态学分析仪与全自动血液分析仪对中性早幼粒细胞计数的差异无统计学意义(P>0.05)。采用全自动细胞形态学分析仪和手工计数法对6类成熟WBC种类、3类幼稚粒细胞及异型淋巴细胞计数的结果均相近,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。由此可见, 3种方法比较结果差异的主要来源是全自动细胞形态学分析仪与全自动血液分析仪,全自动细胞形态学分析仪和手工计数法对绝大多数白细胞种类计数具有可比性,结果可靠。

表1 全自动细胞形态学分析仪、全自动血液分析仪和手工计数法的WBC计数结果

A: 中性杆状核粒细胞计数情况; B: 中性分叶核粒细胞计数情况; C: 淋巴细胞计数情况; D: 单核细胞计数情况;E: 嗜酸性粒细胞计数情况; F: 嗜碱性粒细胞计数情况。与血液分析仪比较, ****P<0.000 1。

2.3 全自动细胞形态学分析仪与手工计数法的相关性分析

对WBC样本进行Passing-Bablok回归分析,计算全自动细胞形态学分析仪与手工计数法结果的相关性,结果显示, 6类成熟WBC(中性分叶核粒细胞、中性杆状核粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)的全自动细胞形态学分析仪与手工计数法计数结果相关性良好(相关系数r>0.8, 截距均接近0, 斜率均接近1), 表明全自动细胞形态学分析仪与手工计数法结果具有较好的一致性。这6类细胞的斜率均接近或等于1, 一致性较好。在中性分叶核粒细胞的Passing-Bablok回归方程中,截距为0, 表明2种方法间没有恒定系统误差。其余异常WBC因样本量较小或数据计算过程中存在过多待定回归系数的重抽样样本,无法进行回归分析。见图3、表2。

表2 全自动细胞形态学分析仪与手工计数法的相关性分析

A: 2种方法在中性杆状核粒细胞中的相关性; B: 2种方法在中性分叶核粒细胞中的相关性; C: 2种方法在淋巴细胞中的相关性;D: 2种方法在单核细胞中的相关性; E: 2种方法在嗜酸性粒细胞中的相关性; F: 2种方法在嗜碱性粒细胞中的相关性。

3 讨 论

尽管外周血形态学具有重要的诊断作用,但没有用于定义细胞学变量的客观值。血细胞独特的细胞学特征是主观的,并受审阅者解释的影响[9]。目前基于外周血涂片自动形态学计算机成像的新型血液分析仪在国内外快速发展,随着生物信息学和生物医学应用的需求不断增加,血细胞形态分析受到了广泛关注[10-11]。基于AI技术的数字显微镜和计算机图像分析可以提供更准确和客观的形态学评估,将细胞学定性参数转化为定量值。基于图像分析的定量形态学特征可提取大量描述相关细胞形态特征的测量值和参数; 通过自动或计算机化图像分析从数字图像中提取有意义的信息,从而达到对不同类别的细胞进行预分类的目的[9]。本研究评估的全自动细胞形态学分析仪根据AI神经网络系统可将WBC分为19类,包括成熟WBC和异常细胞。由于目前该设备临床评估较少,因此本研究对该仪器的WBC预分类功能进行评估和比较。

本研究结果表明,采用3种不同的方法(全自动细胞形态学分析仪、全自动血液分析仪和手工计数法)检测相同的血液样本,全自动细胞形态学分析仪可识别出最多的WBC种类共12类,包括了6类成熟WBC和6类异常细胞,其中原始细胞和浆细胞是全自动细胞形态学分析仪所特有识别的。全自动细胞形态学分析仪采用了深度学习的神经网络算法,机器学习分类器使用360种以上的特征进行训练,用于自动识别异常细胞图像,可大大提高不同类型细胞识别的符合率和检出率[12-13]。

细胞识别谱是指自动化血细胞分析仪能识别分类或判定细胞形态学特征并可给出细胞预分类、细胞形态学变化预表征结果的各种细胞类型或形态学特征的集合[12]。细胞识别谱的范围越宽,细胞种类越完整,形态学特征判定越精准,血细胞形态学分析仪的临床适用范围越广,尤其是对异常细胞的识别,可减少临床疾病尤其是恶性血液病的漏检率,及时为临床提供有价值的细胞诊断信息[14-16]。由于异常细胞形态多变,有些异常细胞的特性还不典型,手工计数法极大地依赖于识别者的知识结构和经验,基于不同专家之间存在识别差异,常常会出现漏检甚至是误检。AI辅助血细胞形态学检查的规范化、标准化,可保证AI血细胞形态学检查结果的准确性和一致性。

3种方法对WBC种类计数结果显示,全自动细胞形态学分析仪对6类成熟WBC、各阶段幼稚细胞和异常细胞(异型淋巴细胞)计数与手工计数结果无显著差异,具有良好的一致性; 全自动细胞形态学分析仪和全自动血液分析仪对WBC计数的差异较大,显示了2种机器不同的WBC分类性能。相关性结果显示,全自动细胞形态学分析仪和手工计数法计数6类成熟WBC有良好的相关性。除中性分叶核粒细胞相关系数r>0.8外,其余成熟WBC的2种方法计数结果相关系数r>0.9, 这可能是由于该仪器拍摄的中性分叶核粒细胞图像与显微镜下直接观察到的细胞形态有一定的差别。参考细胞库的容量会影响细胞预分析结果的符合率。在使用扩充的参考细胞库预分析时,具有重要临床意义细胞的分析符合率较使用初始参考细胞库时有明显提高[17]。由此提示,在实际工作中需要不断完善参考细胞库以提高预分析结果的符合率。由于异常细胞阳性标本较少,异常细胞的相关性分析无法进行。后续研究将继续收集异常细胞的样本,进一步分析其全自动细胞形态学分析仪计数与人工计数结果的相关性。

综上所述,全自动细胞形态学分析仪可分类更多的WBC种类,可提供与手工显微镜检高度一致的WBC计数结果,且两者计数具有良好的相关性。AI在血细胞形态分析上的应用可大大提高WBC形态分析的效率,在保证检查结果准确性的同时减少人力投入,提高血细胞分析质量,降低相应疾病的漏检率。