葛根素对D-半乳糖诱导衰老小鼠心脏的保护作用❋

宋 冲,杜 青,李心亮△

(1.长沙民政职业技术学院医学院,长沙 410004;2.湖南中医药研究院中药研究所,长沙 410006)

衰老是一个持续的生理过程,伴随着细胞、组织和器官的物质、形态和功能退化[1]。然而,衰老症状直到一个人到了特定的年龄阶段才会出现。由于人口的快速增长以及平均寿命的增长,人口老龄化已成为全球趋势,衰老正成为一个严重的社会经济问题。临床数据表明,老年人心脏病的发病率和病死率明显高于青年人[2]。在过去的几十年,研究人员发现心脏衰老往往会导致心血管疾病,如心肌缺血、动脉粥样硬化和心脏纤维化,最终导致心力衰竭。此外,衰老也被认为是心血管手术的危险因素[3]。因此,迫切需要寻找新的抗衰老药物,以减轻与衰老相关的心脏损伤,改善老年人的健康。

新近研究表明,从植物中分离出的天然活性物质或成分可能是预防和治疗衰老相关疾病的候选药物,如银杏叶提取物、白藜芦醇和风流草总醇提物等[4-6]。葛根是一种具有生物活性的中草药,在食品和医药行业有广泛的应用。其中葛根素是从葛根中分离得到的主要药理活性成分,广泛应用于心血管疾病的治疗[7-8]。然而,迄今为止尚未研究葛根素对D-半乳糖诱导的心脏衰老的影响。因此,本研究拟通过建立D-半乳糖诱导的心脏衰老和损伤模型,进一步明确葛根素的抗衰老活性及其潜在的可能机制。实验方案经湖南省中医药研究院医学动物福利委员会批准,编号:SYXK-2016/0002。

1 材料和方法

1.1 动物

雄性昆明小鼠,6～8周龄,体质量为18～22 g,购自北京维通利华实验动物中心,实验动物许可证号:SYXK(湘)2020-0024。所有实验均根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行,所有实验小鼠于湖南省中医药研究院动物中心饲养,相对湿度55%,温度25 ℃,分笼喂养于光照/黑暗为12 h/12 h的恒温环境,自由摄食和饮水,适应性饲养1 周后进行实验。

1.2 药物、主要试剂和仪器

葛根素购自元烨生物科技有限公司,货号:P111270;D-半乳糖购自美国Sigma公司,货号:V900922;总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒购自碧云天生物技术公司,货号:S0109;丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒购自碧云天生物技术公司,货号:S0131S;活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒购自碧云天生物技术公司,货号:S0033S;p21、p53、4-羟基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)一抗均购自英国Abcam公司,货号分别为:ab109199、ab131442、ab46545;Western blot二抗购自北京全式金生物技术公司,货号:HS231-01。

C8000自动生化分析仪,美国Abbott Pharmaceutical公司;MULTISKANMK3型全自动多功能酶标仪、ST16R高速冷冻离心机,美国赛默飞世尔科技公司;CX33型光学显微镜,日本奥林巴斯有限公司;RM2235型石蜡组织切片机,德国徕卡公司。

1.3 分组与造模

24只小鼠随机分为4组,每组6只:对照组,D-半乳糖组,葛根素低剂量组(200 mg/kg,灌胃60 d),葛根素高剂量组(400 mg/kg,灌胃60 d)。除对照组外,其余各组小鼠均给予连续60 d每日颈部皮下注射D-半乳糖0.9%氯化钠溶液500 mg/kg,对照组颈部皮下注射等体积0.9%氯化钠溶液。除对照组外,其他3组小鼠逐渐出现毛色晦暗,易脱落,皮肤弹性差,精神萎靡,倦怠嗜睡,进食明显减少,体质量增加缓慢,呈现明显衰老体征,表明衰老小鼠模型构建成功。

1.4 给药方法

葛根素混悬液的制备:取葛根素干粉200 mg, 加入0.5%的羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose sodium,CMC-Na)溶液10 mL,配制成20 mg/mL的葛根素混悬液。葛根素低剂量组与高剂量组每日分别灌胃低剂量(200 mg/kg)和高剂量(400 mg/kg)的葛根素混悬液一次,对照组和D-半乳糖组在相同时间点灌服等量的0.9%氯化钠溶液。连续灌胃60 d,每周称量体质量,灌胃给药的实际剂量根据小鼠体质量的变化实时调整。葛根素的剂量根据预实验确定。

1.5 处死与取材

所有动物均通过腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行麻醉。通过眼眶采血获得血样。解剖心脏并用冷0.9%氯化钠溶液冲洗。一部分心脏置于10%福尔马林溶液中固定保存,用于组织病理学观察。剩余部分心脏在液氮中快速冻存,然后置于-80 ℃冰箱保存备用,用于进一步的生化分析。

1.6 肌酸激酶(creatine kinase,CK)和心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)测量

从动物身上采集的血样在4 ℃下离心获得血清。采用自动生化分析仪检测血清cTnT和CK生化指标。CK和cTnT测定按照试剂说明书进行。

1.7 ELISA法检测MDA含量和SOD活性

将心肌组织和0.9%氯化钠溶液按1:9比例通过超声处理制备10%的心脏组织匀浆,之后,将裂解的组织匀浆离心取上清液配制成适当的浓度,严格按照试剂盒说明书步骤操作,测定MDA和SOD活性的含量。

1.8 活性氧测量

取心肌组织快速置于-20 ℃冰箱冻存,冰冻切片机切片,之后取二氢乙锭(dihydroethidium,DHE)置于冰冻切片孵育,检测细胞内ROS水平。细胞内DHE被氧化成乙锭,乙锭与DNA结合,使细胞核染成明亮的荧光红色。心肌组织切片ROS水平的检测按照试剂盒说明书进行。

1.9 免疫组织化学染色

将心肌组织包埋在石蜡中并切片(5 μm)。通过用0.3% H2O2处理淬灭内源性过氧化物酶活性,然后用1% Triton X-100 和1%正常兔血清孵育2 h。切片用对应的一抗(8-OHdG,1:500)4 ℃孵育过夜,然后滴加山羊抗小鼠二抗(1:1 000)孵育约2 h。通过二氨基联苯胺引起的显色反应检测出阳性信号。荧光显微镜下观察免疫组织化学图像。

1.10 Western blot

用放射免疫沉淀法缓冲液(Radioimmunoprecipitation assay buffer,RIPA缓冲液)[含0.1% 苯甲磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride,PMSF)]研磨心肌组织以提取蛋白质。将等量的蛋白质通过10%或12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜中。之后5%脱脂牛奶封闭膜1 h,4 ℃一抗孵育过夜,之后二抗室温下孵育1 h。采用ImageJ 1.43分析软件检测分析化学发光信号和条带强度。一抗的稀释比例如下:p21 (1:1 000)、p53 ( 1:1 000)、4-HNE (1:1 000) 和GAPDH (1:2 000)。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 葛根素减轻 D-半乳糖诱导的衰老小鼠的心肌损伤

4-半乳糖诱导的心肌损伤是用于研究心脏衰老的常见模型。本研究采用苏木精-伊红( hematoxylin-eosin,HE)染色观察心肌形态学改变。结果显示,与对照组比较,D-半乳糖组小鼠心肌组织炎症浸润和心肌纤维排列紊乱,心肌纤维结构破坏严重,与D-半乳糖组比较,葛根素给药组小鼠的心肌细胞排列整齐有序,心肌纤维无断裂和结构破坏,组织炎症反应明显减轻,见图1。此外,心肌组织损伤酶的变化如CK和cTnT,如图1所示,与对照组比较,D-半乳糖组小鼠血浆CK和cTnT水平升高,而与D-半乳糖组比较,葛根素给药组小鼠血浆中这些特异性心肌酶水平明显降低,表明葛根素可减弱D-半乳糖诱导的心肌损伤。

注:与对照组比较**P<0.01;与D-半乳糖组比较#P<0.05;心肌肌钙蛋白T(cTnT),肌酸激酶(CK)A.心肌组织HE染色典型图(×200);B、C.葛根素对心肌组织损伤酶CK和cTnT含量影响的定量分析图1 葛根素对D-半乳糖诱导的心肌损伤的影响(n=3)

2.2 葛根素抑制D-半乳糖诱导的衰老小鼠心脏相关指标

文献认为,衰老与p21和p53表达上调密切相关[9]。因此,本研究对心肌组织进行了p21和p53蛋白表达检测来反映心脏衰老水平。结果显示,与对照组比较,D-半乳糖组小鼠心肌组织p21和p53表达上调,与D-半乳糖组比较,葛根素给药组可以逆转这些改变,见图2。这些结果表明心脏衰老模型的建立是成功的,同时葛根素可以抑制D-半乳糖诱导的心脏衰老。

注:与对照组比较**P<0.01;与D-半乳糖组比较#P<0.05A.葛根素对p21和p53表达影响的典型图;B.葛根素对心肌组织p21和p53表达影响的定量分析图2 葛根素对D-半乳糖诱导的心肌p21和p53表达的影响(n=3)

2.3 葛根素抑制D-半乳糖诱导的衰老小鼠心肌氧化应激

氧化应激在心脏衰老过程中起关键作用,ROS的过度产生被认为是典型特征。如图3所示,使用ROS荧光探针DHE测量心肌中的ROS水平,结果显示D-半乳糖组小鼠心肌ROS水平升高。抗氧化酶SOD负责氧化应激过程中促氧化剂和抗氧化剂的平衡,脂质氧化产物MDA也反映了氧化应激水平。结果表明,与对照组比较,D-半乳糖组小鼠MDA含量显著提高,SOD活性降低,表明动物心肌组织氧化应激水平升高。然而与D-半乳糖组比较,葛根素给药组抑制D-半乳糖诱导的心肌氧化应激,表现为ROS水平和MDA含量降低,以及SOD含量增加。

注:与对照组比较**P<0.01;与D-半乳糖组比较#P<0.05;活性氧(ROS),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)A、B.葛根素对ROS的影响(×200);C.葛根素对心肌组织MDA含量的影响; D.葛根素对心肌组织SOD含量的影响图3 葛根素对D-半乳糖诱导的心肌氧化应激的影响(n=6)

2.4 葛根素减轻D-半乳糖诱导的衰老小鼠氧化应激诱导的心肌脂质过氧化和DNA损伤

增加的氧化应激诱导组织脂质过氧化和DNA损伤,最终导致心脏老化和损伤。为了进一步证实葛根素对D-半乳糖诱导的心脏衰老和损伤的保护作用,本研究检测了脂质过氧化和DNA损伤相关指标。4-HNE和8-OHdG分别是代表脂质过氧化和DNA损伤的典型标志物。如图4所示,免疫组化结果表明,与对照组比较,D-半乳糖组小鼠心肌组织8-OHdG上调,而与D-半乳糖组比较,葛根素给药组减轻D-半乳糖对心肌组织8-OHdG的影响。Western blot结果显示4-HNE蛋白表达与前述指标一致的趋势。这些结果表明葛根素可以减轻D-半乳糖诱导的小鼠心肌组织氧化应激诱导的脂质过氧化和DNA损伤。

注:与对照组比较**P<0.01;与D-半乳糖组比较#P<0.05;4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)A.葛根素对8-OHdG表达的影响(×20);B.4-HNE蛋白表达情况;C.4-HNE表达定量统计图4 葛根素对D-半乳糖诱导的心肌损伤脂质氧化和DNA损伤的影响(n=3)

3 讨论

葛根素是从中药干燥根茎葛根提取获得的药理活性成分,是一类异黄酮类化合物,已被证实具有抗衰老、抗炎、神经保护和抗氧化、促进成骨细胞分化和保肝等多种作用[10-13]。新近研究发现,葛根素通过14-3-3γ/蛋白激酶Cε(14-3-3γ/protein kinase Cε,14-3-3γ/PKCε)通路激活适用性自噬保护阿奇霉素诱导的心肌毒性,表明葛根素对心脏具有保护作用[14]。

近年来,越来越多的研究表明,心血管疾病的发病率和病死率随着老龄化而增加,公众对老年人潜在健康风险的关注度不断提高。为了研究个体衰老的机制并评估抗衰老药物在整体器官和组织水平上的疗效,许多学者建立了多种实验性衰老动物模型,其中D-半乳糖诱导的衰老动物模型是公认的较为理想的衰老模型[15]。文献报道,低剂量的D-半乳糖注射液可诱导小鼠衰老加速作用[16-17]。D-半乳糖在体内形成晚期糖基化终产物,升高的晚期糖基化终产物可能加速衰老过程[18],在D-半乳糖处理的小鼠中观察到自由基紊乱、线粒体功能障碍和细胞损伤,这与自然衰老的小鼠相似。此外,D-半乳糖处理导致衰老相关基因包括p16和p21表达上调[19]。总之,来自D-半乳糖的晚期糖基化末端衍生产物对衰老过程的促进可能归因于其对氧化应激和衰老相关基因的影响。

本研究通过持续60 d皮下注射D-半乳糖建立衰老模型小鼠。与对照组比较,D-半乳糖引起动物出现明显的运动频率降低和毛皮粗糙,表明D-半乳糖损伤具有促衰老作用。CK和cTnT被认为是在临床评估心脏损伤可靠的心肌损伤标志物[20]。本研究在D-半乳糖处理的小鼠中发现心肌纤维不规则排列和血浆CK和cTnT水平升高。细胞周期停滞也是不可逆衰老的重要指标。端粒功能障碍和 DNA 损伤被证明是细胞周期停滞的开始[21]。作为DNA损伤的下游效应因子之一,肿瘤抑制因子p53上调细胞周期调节蛋白p21以将细胞阻滞在细胞周期的G1期[22-23]。Western blot结果显示,D-半乳糖组p53和 p21的表达上调,表明D-半乳糖成功诱导小鼠心脏衰老。进一步结果表明,葛根素可减轻D-半乳糖诱导的心脏衰老和损伤。据报道,葛根素通过上调糖皮质激素受体,减轻氧化应激,抑制炎症反应,延缓大脑、肾脏等组织的衰老[24-25]。然而,葛根素抑制心脏衰老的机制仍不清楚。众所周知,ROS主要是由线粒体中发生的呼吸反应中的电子传递产生的。ROS积累引起的DNA损伤被认为是衰老的重要原因。ROS可以靶向核苷酸库,提高p21、p53和p16的表达,最终加速细胞衰老过程[26]。此外,过度的氧化应激会破坏线粒体的氧化还原平衡,诱导脂质过氧化,并破坏线粒体的膜结构、内质网和细胞本身,逐渐导致衰老和功能退化[27]。本研究发现葛根素可以抑制D-半乳糖诱导的衰老小鼠心脏脂质过氧化和DNA损伤,进一步证实葛根素通过抑制氧化应激来减轻心脏衰老。

然而,本研究仍有一些局限。尽管葛根素总体上对身体有益,但缺乏葛根素单独组可能会引起对葛根素安全性的怀疑。此外,还没有进行体外实验来验证体内结论,抗衰老作用的详细机制也没有进行。值得在体外进行探索,这将是课题组进一步研究的重点。

总之,本研究首先证明了葛根素对D-半乳糖诱导的天然衰老模型小鼠的保护作用,其机制与抑制心肌组织的氧化应激有关。这些结果可能为支持葛根素在抗衰老治疗中的作用提供科学依据。