基于网络药理学探讨茯苓-泽泻药对治疗慢性肾炎的作用机制

谭钞芳，高常柏

天津中医药大学，天津 300000；天津中医药大学第二附属医院，天津 300150

慢性肾炎是一组源于肾小球的疾病，其病因复杂多样，病理类型繁多，起病缓慢，病情迁延，是发展为慢性肾衰竭的主要原因[1-2]，临床常表现为水肿、蛋白尿、血尿、血压高和肾功能异常等[3]。慢性肾炎发病机制目前仍不清楚，但一般认为与免疫炎症损伤关系密切。目前，临床治疗慢性肾炎主要以糖皮质激素、免疫抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）等药物为主，其中激素与免疫抑制剂不良反应较多，ACEI安全性虽较前两者高，但单独使用难以达到满意疗效[4]。研究表明，中药联合糖皮质激素治疗慢性肾炎较单纯西医治疗更具优势，其临床疗效更显著，不良反应发生率更低[5]。根据其临床症状，慢性肾炎属中医学“水肿”“尿血”范畴。《黄帝内经》有“风水”“石水”“涌水”之分，并提出“故其本在肾，其末在肺”“诸湿肿满，皆属于脾”，认为该病病机与肺、脾、肾三脏关系密切。后张仲景提出“诸有水者，腰以下肿，当利小便，腰以上肿，当发汗乃愈”，为水肿的治疗提供了新思路。

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核，有利水渗湿、健脾宁心之功，利水而不伤正，为利水消肿要药；泽泻为泽泻科植物泽泻Alismaorientalis(Sam.) Juzep的干燥块茎，有利小便、泄湿热之功，可用于治疗水肿、淋证等。本研究运用网络药理学方法，对茯苓-泽泻药对的活性成分及作用靶点进行预测分析，探讨其治疗慢性肾炎的潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 茯苓-泽泻药对活性成分筛选及靶点预测

检索TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中茯苓、泽泻的化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件，筛选茯苓、泽泻的活性成分。在TCMSP检索活性成分的分子结构式，并下载mol2类型文件，将文件导入PharmMapper数据库，设定“Human Protein Targets Only”，预测茯苓-泽泻活性成分的作用靶点。根据标准化拟合得分进行排序，选择得分≥0.9的靶点，删除重复值，得到作用靶点。运用UniProt数据库（https://www.uniprot.org）对靶点名称进行规范。

1.2 茯苓-泽泻药对“活性成分-靶点”网络构建

将中药、活性成分及靶点信息导入Cytoscape3.8.2软件，构建茯苓-泽泻药对“活性成分-靶点”网络，并进行网络拓扑分析，筛选主要活性成分。

1.3 慢性肾炎疾病靶点筛选

以“chronic glomerulonephritis”“chronic nephritis”为关键词，检索GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM数据库（https://omim.org），获得慢性肾炎相关靶点，合并数据并删除重复值，得到慢性肾炎相关靶点，并利用UniProt数据库对靶点名称进行规范。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及关键靶点筛选

将药物活性成分靶点和慢性肾炎相关靶点上传至Venny2.1在线作图工具平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），构建韦恩图，得到药物与疾病的交集靶点。将交集靶点导入STRING数据库（https://string-db.org），设置生物种类为“Homo Sapiens”，选择中等置信度（0.40），获得蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。将节点和结合率评分信息导入Cytoscape3.8.2软件，利用CytoNCA插件进行网络拓扑分析，以中介中心性、接近中心性、度中心性均大于相应中位数的靶点为茯苓-泽泻药对治疗慢性肾炎的关键靶点。

1.5 生物信息学分析

将关键靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov）进行GO功能与KEGG通路富集分析，设定P＜0.05，并利用微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn）对富集靶点数排名前10位的生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分子功能（MF）及前20条KEGG信号通路进行可视化分析。

2 结果

2.1 茯苓-泽泻药对活性成分及靶点

检索TCMSP，获得茯苓、泽泻化学成分34、46个，以OB≥30%、DL≥0.18为条件，筛选得到茯苓活性成分15个，泽泻活性成分10个，见表1。利用PharmMapper数据库预测得到茯苓-泽泻活性成分的作用靶点89个。

表1 茯苓-泽泻药对活性成分（OB≥30%、DL≥0.18）

2.2 茯苓-泽泻药对“活性成分-靶点”网络

采用Cytoscape3.8.2软件构建茯苓-泽泻“活性成分-靶点”网络，见图1。网络包括116个节点（作用靶点89个，活性成分25个，药物2个）与895条边。其中，节点面积越大度值越高，涉及的生物功能越多，生物学重要性越高。度值排名前5位的活性成分分别为茯苓新酸A（poricoic acid A）、泽泻醇C（alisol C）、茯苓新酸B（poricoic acid B）、去氢茯苓酸[7,9(11)-dehydropachymic acid]、23-乙酰泽泻醇B（alisol acetate B）。

图1 茯苓-泽泻药对“活性成分-靶点”网络

2.3 慢性肾炎相关靶点及交集靶点获取

检索GeneCards、OMIM数据库，分别得到慢性肾炎靶点1 661、98个，合并后删除重复靶点，获得1 240个慢性肾炎相关靶点。采用Venny2.1在线作图工具对茯苓-泽泻药对作用靶点和慢性肾炎疾病靶点取交集，得到药物与疾病的交集靶点31个。

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及关键靶点筛选结果

将交集靶点导入STRING数据库，构建PPI网络，网络包括31个节点、268条相互作用线，见图2。采用Cytoscape3.8.2的CytoNCA插件进行拓扑分析，得到15个关键靶点，包括ALB、EGFR、SRC、CASP3、NOS3、F2、ESR1、MAPK14、ANXA5、MAPK1、PPARG、MMP3、MAPK8、KDR、CCNA2，见图3。

图2 茯苓-泽泻治疗慢性肾炎靶点PPI网络

图3 茯苓-泽泻治疗慢性肾炎关键靶点PPI网络

2.5 关键靶点GO功能富集分析

GO功能富集分析得到106个条目（P＜0.05），其中BP条目70个、CC条目15个、MF条目21个。BP主要涉及细胞凋亡的负调节过程（negative regulation of apoptotic process）、学习或记忆（learning or memory）、DNA模板转录正调控（positive regulation of transcription,DNA-templated）等；CC包括细胞质（cytoplasm）、膜筏（membrane raft）、细胞核（nucleus）、陷窝（caveola）、细胞外组分（extracellular region）等；MF相关条目有酶结合（enzyme binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、丝裂原活化蛋白激酶活性（MAP kinase activity）等。筛选出富集靶点数排名前10位的条目，见图4。

图4 茯苓-泽泻治疗慢性肾炎靶点GO功能富集分析

2.6 关键靶点KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析结果显示，得到81条信号通路（P＜0.05），主要涉及血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、白细胞介素-17（IL-17）信号通路等。选取富集靶点数排名前20位的信号通路，见图5。

图5 茯苓-泽泻治疗慢性肾炎关键靶点KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

本研究对茯苓-泽泻药对活性成分及其作用靶点进行分析，结果显示，茯苓-泽泻药对治疗慢性肾炎的主要活性成分为茯苓新酸A、泽泻醇C、茯苓新酸B、去氢茯苓酸及23-乙酰泽泻醇B。茯苓新酸A、茯苓新酸B及去氢茯苓酸均为三萜类化合物，具有调节免疫、抗炎及抗肿瘤等药理作用[6]。23-乙酰泽泻醇B具有良好的利尿、降血脂、降血糖及抗炎等作用，其利尿作用可能与肾末端血管的Na+-Cl-协同转运蛋白有关[7]。

茯苓-泽泻治疗慢性肾炎的关键靶点包括ALB、EGFR、SRC、CASP3等。ALB是血液中最普遍的蛋白质，可结合和运输不同种类的分子，包括激素、维生素、胆汁酸、阳离子、胆红素等。研究表明，血清白蛋白超负荷可诱导肾小球中环氧化酶（COX-2）表达，而COX-2是肾脏血流动力学和炎症的关键调节剂[8]。EGFR是在肾脏中表达的膜酪氨酸激酶受体，在肾损伤后被激活[9]。研究发现，EGFR抑制剂可减轻肥胖引起的肾损害，其作用机制可能与降低转化生长因子β表达，从而抑制肾纤维化，以及缓解血管紧张素2诱导的氧化应激反应和炎症反应等相关[10]。SRC是一种细胞内非受体酪氨酸激酶，集成了多个细胞外信号输入，可触发成纤维细胞的活化和增殖，并使肾小管细胞通过诱导细胞周期停滞获得促纤维化表型，从而导致肾纤维化[11]。CASP3分子是一类在进化上非常保守的蛋白酶类分子，不仅在微血管内皮凋亡过程中起重要调节作用，还与参与炎症反应，与肾脏炎性损伤密切相关[12]。

关键靶点GO功能富集结果表明，茯苓-泽泻药对治疗慢性肾炎涉及细胞凋亡的负调节过程、学习或记忆、DNA模板转录正调控等生物学过程；分子功能主要富集于酶结合、蛋白磷酸酶结合、丝裂原活化蛋白激酶活性等。细胞凋亡的负调节过程即抑制细胞凋亡，有研究发现，CD36蛋白可介导脂质摄取，进而诱导足细胞凋亡，破坏肾小球滤过膜，导致蛋白尿产生[13]，所以抑制细胞凋亡在延缓肾脏疾病中起重要作用。

KEGG通路主要富集于VEGF信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等，提示茯苓-泽泻可能通过这些通路起到治疗慢性肾炎的作用。VEGF是内皮细胞的促血管生成和存活因子，在血管生成中起核心作用。研究发现，服用VEGF抑制剂的患者可能会出现肾小球微血管病变，还可能会出现血压升高，进一步造成肾脏损害[14]，因此，茯苓-泽泻可能是通过VEGF信号通路改善肾脏功能。Wen等[15]通过动物实验发现，携带巨噬细胞特异性缺失TNF-α小鼠在模型中表现出肾小球和肾小管损伤减少及肾纤维化减轻。此外，还发现使用TNF受体-1抑制剂R-7050可治疗肾炎小鼠。表明茯苓-泽泻可能是通过TNF信号通路减轻肾损伤、抑制肾纤维化及减轻炎症反应等。

综上所述，本研究预测茯苓-泽泻药对治疗慢性肾炎的活性成分、作用靶点及信号通路，推测茯苓泽泻药对治疗慢性肾炎可能与调节免疫、抗炎、改善肾脏血流等关系密切。但网络药理学仍有一定局限性，其结果有待于动物实验或临床试验进一步验证。