植物蛋白饮料中蛋白质含量的测定结果不确定度评价

刘顺

（荆州职业技术学院，湖北荆州 434000）

植物蛋白饮料的蛋白质含量是目前我国市场监督抽检项目的重要理化指标，涉及的产品种类主要有豆乳饮料、椰子乳、杏仁乳、核桃乳[1]，其依据的判定要求为产品明示标准或产品明示质量要求。通过总结国家市场监管总局关于食品抽检不合格情况的通告，发现植物蛋白饮料的质量指标[2,3]不达标问题主要集中于蛋白质项目，为保障食品检验项目的准确性有必要探究检测蛋白质结果的不确定度[4-8]。

目前植物蛋白饮料中蛋白质含量的测定方法[9]为GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（第一法 凯氏定氮法），相较于GB 5009.5-2010 版标准，增加了常见食物中氮折算成蛋白质的折算系数，新标准对产品不同产品类别的计算结果更加具有针对性、科学性。标准中规定的第一法可采用自组装的定氮蒸馏装置或者自动凯氏定氮仪[10]，自组装蒸馏装置结束蒸馏后再通过手动滴定法滴定至终点，自动凯氏定氮仪可实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程，两种滴定方法均是通过混合指示剂颜色变化确定滴定终点。标准中对于液体试样要求称样量为10 g～25 g（约相当于30 mg～40 mg 氮），植物蛋白饮料标称的蛋白质含量换算为30 mg 含氮量，而一般市场销售的自动凯氏定氮仪配置的滴定仪在滴定体积达到40.00 mL 后可能出现滴定杯液溢出，进而导致滴定终点的体积测定不准确影响最终结果的准确度。对于自组装定氮蒸馏装置因采用传统手动滴定法，通过选择合适体积的接受瓶及四氟滴定管即可保证滴定至终点。本文拟采用自动凯氏定氮仪的蒸馏部分与手动滴定部分结合后，依据CNAS-GL006《化学分析中不确定度的评估指南》[11]和RB/T 030《化学分析中测量不确定度评估指南》对植物蛋白饮料中蛋白质含量的测定结果不确定度进行分析[12-15]，通过对测量过程中不确定度来源分析，减小对检测结果产生较大影响的不确定度，进而提高食品检验过程的质量控制能力和检测结果的准确度。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

全自动凯氏定氮仪：K-360 型，瑞士步琦实验室仪器有限公司；电子天平：ME204/02 型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；能力验证样品（豆奶饮料）：中位值蛋白质1.90 g/100 g，中国食品药品检定研究所；硫酸铜、硫酸钾、硼酸、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、氢氧化钠、95%乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠：基准PT，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 蛋白质的测定

参照GB 5009.5-2016（第一法）：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量计算氮含量，再乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

1.3 计算公式

根据标准检测方法，食品中蛋白质的测定按式（1）进行计算：

式中：m-试样质量，g；V1-试样消耗硫酸标准溶液体积，mL；V2-空白消耗硫酸标准溶液体积，mL；C-硫酸标准溶液的实际浓度，mol/L；0.014 0-1.0 mL 硫酸标准滴定溶液相当的氮的质量，g；100-换算系数；F-氮换算为蛋白质的系数（各种食品中氮换算系数见标准附录A）；X-检测结果，g/100 g。

1.4 蛋白质测定不确定度影响因素分析

根据GB 5009.6-2016 第一法测定质控样品中蛋白质含量的测量不确定度分析来源主要有检测过程重复性引入的不确定度urel(r1a)、试样质量引入的不确定度urel(m1a)、滴定管滴定引入的不确定度urel(V1a)、硫酸标准溶液引入的不确定度urel(c1a)。

2 结果与分析

2.1 检测过程重复性引入的不确定度urel(r)评定

对于检测过程重复性引入的不确定度urel(r)，依据检验标准检验方法，指示剂滴定法8 次测得豆奶样品蛋白质含量的均值为1.851 g/100 g（1.841，1.837，1.859，1.838，1.841，1.832，1.882，1.875），计算标准偏差S和检测过程重复性引入的不确定度urel(r)。

2.2 质量称量引入的不确定度urel(m)

天平校准产生的不确定度一般由天平计量证书给出，按标准要求准确称量样品精确至0.001 g，最大允许误差±5 mg，按均匀分布评定，取，则：

2.3 配制硫酸标准溶液的不确定度urel(c)

根据GB/T 601-2016 进行硫代硫酸钠标准溶液的配制及标定：

式中：m-基准试剂质量，g；V-试样消耗硫酸标准溶液体积，mL；V0-空白消耗硫酸标准溶液体积，mL；M-无水碳酸钠的摩尔质量浓度，g/mol；硫酸标准溶液的实际浓度，mol/L。

（1）标定重复性引入的不确定度分量：平行测定8 次所得硫酸标准溶液浓度均值为0.102 12 mol/L（0.102 17，0.102 08，0.102 18，0.102 05，0.102 08，0.102 18，0.102 09，0.102 16），对于检测过程重复性引入的不确定度ur(rep)：

（2）称量Na2CO3引入的不确定度分量：天平校准产生的不确定度一般由天平计量证书给出，按标准要求准确称量样品精确至0.000 01 g，最大允许误差±0.05 mg，按均匀分布评定，取，则：

基准试剂无水碳酸钠引入的不确定度主要来源于纯度和摩尔质量，根据标准证书记录的纯度（99.99±0.02）%，摩尔质量的相对不确定度由国际理论（化学）与应用化学联合会（IUAPC）查表得到在实际应用时可忽略不计，按均匀分布计算得纯度和摩尔质量的不确定度：

（3）滴定基准物质消耗硫酸标准溶液体积引入的不确定度分量

①50 mL A 级滴定管：校准证书误差为0.05 mL，按三角形分布考虑，则u1(V)=0.05=0.020 4 mL。

②实验室温度波动引入的不确定度分量u2(V)：标准情况下温度为20℃，而实验室温度在±4℃波动，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，温度效应引起的体积变化为均匀分布，，则u2(V)=39.98×2.1×10-4=0.004 85。

③将u1(V)、u2(V)两个分量合成，得到：

（4）玻璃量器引入的不确定度分量：依据GB 5009.5-2016 所用硫酸标准滴定溶液浓度为0.050 0 mol/L，因此将0.102 1 mol/L 硫酸溶液稀释至0.051 05 mol/L，具体操作：取50 mL 0.102 1 mol/L 硫酸标准溶液至100 mL 容量瓶，100 mL A 级容量瓶最大允许误差±0.10 mL；50 mL A 级移液管最大允许误差±0.05 mL，服从均匀分布，包含因子，换算成标准不确定度为：

不确定度合成为：

2.4 滴定体积引起的不确定度urel(V)

2.5 合成标准不确定度及扩展不确定度

（3）扩展不确定度：

采用置信概率为95%（k=2）计算，U=kux。

植物蛋白饮料中蛋白质含量各不确定度分量如表1 所示。

表1 不确定度分量汇总

植物蛋白饮料中蛋白质含量测定的不确定度主要由测量重复性、称量、滴定管、标准溶液（标定和稀释）产生，由表1 可知，测定蛋白质含量的第一法测定影响大小为测量重复性>标准溶液>滴定管>称量；蛋白质含量测定结果为=(1.851±0.013 3) g/100 g。

（1）合成相对标准不确定度：

（2）合成标准不确定度：

采用国家标准方法检测植物蛋白饮料中蛋白质含量中测量重复性和标准溶液的不确定度影响较大，本文将GB 5009.5-2016 第一法中自动凯氏定氮仪的蒸馏部分与手动滴定相结合，排除因自动凯氏定氮仪自动滴定部分带来的不确定度分量，同时节约因自组装蒸馏装置消耗的时间，提高基层检测机构试验效率，可通过合理增加测量次数达到减小测量重复性引起的不确定度分量，采用GB/T 601-2016 对硫酸标准溶液进行标定后再依据GB 5009.5-2016 进行适当稀释所产生的不确定度分量需由购买已有扩展不确定度的标准溶液来减小，而基层检验检测机构对于标准物质的期间核查和保质期核查方面存在工作疏忽，即通过增加标定次数和采取精密度较高的稀释容器也可减小标准溶液产生的不确定度分量。

3 结论

本文通过结合GB 5009.6-2016 第一法自动凯氏定氮仪和手动滴定法对植物蛋白饮料中蛋白质含量进行不确定度分析。结果表明，影响植物蛋白饮料中蛋白质含量测定的不确定度主要来源分为测量重复性、称量、滴定管、标准溶液，通过对不确定度分量进行分析得出植物蛋白饮料中蛋白质含量的扩展不确定度，其中测量重复性和标准溶液的不确定度分量占比较大。因此，对于购买自动凯氏定氮仪附加自动电位滴定仪有限制的基层检验检测机构，可优先选择本文中的自动凯氏定氮仪和手动滴定法相结合的方法，增加标准溶液标定和蛋白质含量检测试验的次数，也可按照CNAS-GL035《检测和校准实验室标准物质标准样品验收和期间核查指南》对试验中涉及的标准物质进行验收和期间核查，提高对检验检测结果的质量控制能力。本文未涉及GB/T 27418-2017《测量不确定度评定和表示》中不确定度的通用分析方法，计划在今后的工作研究中可将该标准引入检验检测过程质量控制，进一步提高检验检测结果的可信度。