紫色土上大叶女贞苗接种丛枝菌根真菌后对干旱胁迫的响应

黎 蕾，汤玉喜，李永进，唐 洁，梁军生，杨 艳

(湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004)

紫色土是发育于亚热带紫色砂页岩的一种岩性土，其土层薄、颜色较深、吸热性强、导热性差、保水能力差，在高温干旱环境下极易形成季节性干旱，从而限制植物的生长发育[1]。干旱胁迫会造成植物光合能力下降、降低植物水势、阻碍植物生长，严重时会造成植物死亡[2]。近年来，通过接种丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)解决植物干旱胁迫问题越来越受到重视，相关技术的应用也越来越多[3]。AMF能与绝大多数的陆生植物形成共生体系，在植物应对胁迫时发挥重要作用[4]。大量研究表明，接种AMF能促进植物生长发育，提高植物的抗旱性[5-7]。在干旱胁迫条件下，AMF根外菌丝体依靠其在土壤中形成的庞大菌丝网络改变植物体水分的进出速率，增强了宿主植物对养分和水分的吸收效率，提高了植物的净光合速率和光合水分利用效率[8-10]。在干旱胁迫下，叶片是植物对环境变化最敏感的部位，具有极强的可塑性[11]，其结构特征能反映植物对不同环境变化所形成的生存策略，最能体现植物对环境的适应性[12-13]。因此，研究叶片形态特征对揭示植物的抗旱机理具有重要意义。大叶女贞(LigustrumLucidum)为木犀科(Oleaceae)女贞属(Ligustrum)植物，是南方地区常见的乡土树种，具有较强的耐旱性[14]。目前关于大叶女贞的研究主要集中在其抗寒性、重金属富集、耐盐性、滞尘效应等方面[15]。大叶女贞在绿地土壤修复方面发挥着重要作用，目前在湖南省衡阳地区紫色土坡地上广泛种植，但受限于紫色土保水保肥能力差，通常存在生长迟缓、叶片小且叶色发黄、幼苗极易缺水而难以存活等问题。本研究分析了接种AMF对紫色土干旱胁迫环境下大叶女贞叶片生长与生理特性的影响，以期为紫色土区大叶女贞抗旱和菌根调控技术的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大叶女贞种子于2021年11月采自衡阳市祁东县紫色土区。供试的2种AMF购置于广西农业科学院微生物研究所“亚热带丛枝菌根(AM)真菌资源保藏中心”，分别为摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae，FM)、幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum，CE)菌剂。菌剂由菌根真菌孢子、根外菌丝、菌根化根段及砂土组成。摩西斗管囊霉、幼套近明球囊霉菌剂中分别含有孢子65±5、50±5个·g-1。供试土取自衡阳市祁东县紫色土区0～25cm的表层紫色土，经自然风干并过筛(孔径<4mm)后混合土样，带回实验室测定其基本理化性质。测定结果见表1。

表1 紫色土土壤基本理化性质Tab.1 Basic physical and chemical properties of purple soil有机质含量/(g·kg-1)全氮含量/(g·kg-1)全磷含量/(g·kg-1)全钾含量/(g·kg-1)pH田间持水量/%土壤容重/(g·cm-3)15.001.050.8526.98.2326.23%1.67

1.2 研究方法

1.2.1 试验设计

采取完全随机区组试验设计。设置W1(正常供水，盆内土壤相对含水量为田间持水量的75%±5%)、W2(干旱胁迫，盆内土壤相对含水量为田间持水量的40%±5%)2种水分条件，N0(接种灭菌菌剂10 g)、FM(接种摩西斗管囊霉菌剂10g)、CE(接种幼套近明球囊霉菌剂10g)等3种接种方法，共6种处理，分别为W1N0(CK，接种灭菌菌剂10g和正常浇水)、W1FM(接种FM菌剂10g和正常浇水)、W1CE(接种CE菌剂10g和正常浇水)、W2N0(接种灭菌菌剂10g和干旱胁迫)、W2FM(接种FM菌剂10g和干旱胁迫)、W2CE(接种CE菌剂10g和干旱胁迫)。每种处理接种9盆，共接种54盆。

采用盆栽方式育苗。盆栽用花盆直径15cm，深14cm，每盆装供试紫色土1.7kg。挑选外观均匀一致的大叶女贞种子，使用 10%(V/V)的H2O2溶液对种子表面消毒10min，以无菌水冲洗多次，再浸泡1d后进行催芽处理，然后种植于经高温高压灭菌处理的土中，3d正常浇水1次，直至地上部分长出15cm，根系完整形成时接种AMF菌剂。接种方法是将10g菌剂或灭菌菌剂施于根系部位[8]。试验在人工气候室中进行，气候室中光强为700μmol·m-2·s-1，温度为26℃，光照时间12～14h·d-1。各种处理的植株随机排列，定植1a后，自2023年5月20日开始选取一半的植株进行干旱胁迫，另一半植株仍按正常供水。胁迫开始前充分浇水，土壤相对含水量达饱和后停止浇水，待盆内水分自然消耗至所设定的土壤相对含水量后，开始进行干旱胁迫。控水方法参考牛素贞等[16]的方法，根据土壤含水量、田间持水量和设定的土壤相对含水量计算每处理每重复达到所设定的相对含水量时的盆土质量。随后每2d称量盆土质量并补水，采用称量质量法保持土壤相对含水量稳定，使土壤相对含水量控制在各干旱胁迫处理的范围内，连续控水90d，至2023年8月20日结束干旱胁迫。干旱胁迫结束后测定大叶女贞叶片的光合参数、叶绿素相对含量及叶绿素荧光参数，并采集各处理植株中上部成熟叶片15片，置于冰盒内，迅速带回实验室，测量叶片表型性状和测定叶片干物质含量与相对含水量等。

1.2.2 叶片表型性状测量及生理特性测定

(1)叶片表型性状测量。每份叶片样品选取3～5片健康完整的新鲜叶片，用LI-3000C便携式叶面积仪(LI-COR，美国)测定叶片宽度(最大宽度和平均宽度)、叶片长度、叶面积(LA)。

(2)干物质含量和相对含水量测定。将采集的新鲜叶片浸入去离子水中，放置8h后称量其饱和质量，然后将叶片置于烘干箱内烘48h至恒质量，称量叶片干质量，并计算叶片干物质含量(LDMC)和叶片相对含水量。LDMC=叶片干质量/叶片鲜质量(g·g-1)。叶片相对含水量=(叶片鲜质量-叶片干质量)/(土壤相对含水量达到饱和时的叶片鲜质量-叶片干质量)×100%[17]。

(3)光合参数测定。采用便携式光合作用测定系统Licor-6400(LI-COR，美国)测定光响应曲线，每种处理选择3株，每株选择2片叶片测定。CO2浓度设定为400 μmol·mol-1，CO2由系统自动控制注入。测定前，用1800μmol·m-2·s-1的光强对所测叶片进行15 min光诱导。设置光强梯度由高到低依次为2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、100、80、60、40、20、0 μmol·m-2·s-1，每个梯度光强值设定数据采集时间3min，测定净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)等参数。利用Pn、Tr计算植物水分利用效率(WUE=Pn/Tr)。

(4)叶绿素相对含量测定。使用便携式叶绿素测定仪SPAD-502 Plus(Konica-Minolta，日本)测定叶片的叶绿素相对含量(SPAD值)。每种处理选择3株，每株选择5片叶片测定，每片叶片测定4个部位的SPAD值，4个部位SPAD值的平均值为叶片总体SPAD值。

(5)叶绿素荧光参数测定。使用手持式叶绿素荧光仪FluorPen FP 110(PSI，捷克)测定叶绿素荧光参数，每种处理选择3株，每株选择3片叶片测定。测定方法为叶片暗适应20min后检测叶片叶绿素荧光，记录叶绿素荧光关键参数PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)和非光化学猝灭系数(NPQ)。

1.2.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2016和OriginPro 2017软件进行数据处理及作图，运用SPSS 18.0 软件对各参数进行单因素方差分析和Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 大叶女贞苗接种AMF后叶片生长特性对干旱胁迫的响应

由表2可见：干旱胁迫对紫色土上大叶女贞的叶片数、叶面积、叶长、最大叶宽、平均叶宽、叶片相对含水量、叶片干物质含量等都有显著影响(P<0.05)。干旱胁迫使大叶女贞的叶片数显著减少(P<0.05)，使叶长、平均叶宽及叶面积均显著减小(P<0.05)；使叶片相对含水量显著降低(P<0.05)，其中接种灭菌菌剂、接种FM和接种CE处理的叶片相对含水量比正常供水处理的分别降低了9.81%、1.76%和2.54%，接种AMF处理的降低较少，可见接种AMF提高了大叶女贞对水分变化的适应能力。叶片相对含水量反映了叶片的持水能力，植物受到干旱胁迫时叶片相对含水量通常会降低，降低值越大说明植物对水分的适应性越差[17]。3种处理的叶片干物质含量受干旱胁迫后反而都提高，其中接种灭菌菌剂处理和接种FM处理的叶片干物质含量受干旱胁迫后都显著提高(P<0.05)。这些反映了大叶女贞为更好地适应干旱环境形成的生存策略。

表2 不同处理大叶女贞的叶片性状均值Tab.2 Effects of different treatments on leaf traits of Ligustrum lucidum处理叶片数叶面积/cm2叶长/cm最大叶宽/cm平均叶宽/cm叶片相对含水量/%叶干物质含量/(g·g-1)W1N021±3 bc15.31±4.52 d6.52±0.95 c3.24±0.44 b2.24±0.38 b84.88±0.9 d0.28±0.01 bW1FM67±9 a29.57±2.53 a10.18±1.08 a4.2±0.18 a3.16±0.18 a92.81±0.63 b0.21±0.01 dW1CE56±13 a23.45±4.35 b8.41±0.19 b4.08±0.48 a2.94±0.28 a94.83±0.17 a0.25±0.02 cW2N017±3 c7.65±0.92 e4.13±0.9 d2.28±0.37 c1.43±0.33 c76.55±0.6 e0.32±0.01 aW2FM31±5 b21.39±0.7 bc8.03±1 bc3.72±0.19 ab2.18±0.14 b91.18±0.51 c0.28±0.01 bW2CE26±3 bc16.55±2.16 cd6.42±0.81 c3.61±0.26 ab2.42±0.04 b92.42±0.21 b0.27±0.02 bc 注: 同列不同字母表示差异显著(P<0.05水平)。下同。

由表2还可以看出：在两种水分条件下，接种AMF都能显著提高(P<0.05)紫色土上大叶女贞的叶片数及叶片相对含水量，显著增大(P<0.05)其叶面积。正常供水时，接种FM处理的大叶女贞叶片数、叶面积、叶长、最大叶宽、平均叶宽和叶片相对含水量比接种灭菌菌剂处理的分别提高了219.05%、93.14%、56.13%、29.63%、41.07%和9.34%；接种CE处理的比接种灭菌菌剂处理的分别提高了166.67%、53.17%、28.99%、25.93%、31.25%、11.72%。干旱胁迫时，接种FM处理的大叶女贞叶片数、叶面积、叶长、最大叶宽、平均叶宽和叶片相对含水量比接种灭菌菌剂处理的分别提高了82.35%、179.61%、94.43%、63.16%、52.45%和19.11%；接种CE处理的比接种灭菌菌剂处理的分别提高了52.94%、116.34%、55.45%、58.33%、69.23%和20.73%。在2种水分条件下，与接种灭菌菌剂的处理相比，接种AMF处理的大叶女贞叶片干物质含量都降低了；接种FM对大叶女贞的叶片数增多和叶长、叶宽、叶面积增大等的促进效果都优于接种CE的，其中，叶面积、叶长、叶片相对含水量的差异均显著(P<0.05)。

2.2 大叶女贞苗接种AMF后叶片光合特性对干旱胁迫的响应

在干旱胁迫下，紫色土上大叶女贞叶片的净光合速率(Pn)对光合有效辐射强度(PAR)的响应曲线如图1所示。图1显示：所有处理都表现为随着PAR的加大，大叶女贞叶片的Pn均呈先增大再趋于平稳的变化趋势。当PAR为0～200 μmol·m-2·s-1时，叶片的Pn快速升高；当PAR为200～800 μmol·m-2·s-1时，叶片的Pn上升缓慢；当PAR超过800 μmol·m-2·s-1时，叶片的Pn趋于平缓或下降。可见，过高的PAR甚至可能会抑制大叶女贞的光合作用。大叶女贞在受到干旱胁迫时，其叶片的净光合速率会受到抑制，其中接种AMF处理的抑制程度有所减轻。

图1 不同处理大叶女贞叶片的净光合速率-光合有效辐射强度响应曲线Fig.1 Response curves of net photosynthetic rate-light intensity of Ligustrum lucidum leaves under different treatments

由图2可知：干旱胁迫显著降低(P<0.05)了大叶女贞叶片的气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率，显著提高(P<0.05)了接种AMF处理大叶女贞叶片的水分利用效率。正常供水时，接种FM处理的大叶女贞叶片气孔导度和水分利用效率均显著提高(P<0.05)，与对照相比分别提高了31.27%和21.12%，胞间CO2浓度及蒸腾速率没有显著变化；接种CE处理的大叶女贞叶片气孔导度和水分利用效率均显著提高(P<0.05)，与对照相比分别提高了34.65%和29.58%；胞间CO2浓度及蒸腾速率没有显著变化。干旱胁迫时，接种FM处理的大叶女贞叶片胞间CO2浓度和水分利用效率均显著提高(P<0.05)，分别比对照的提高了26.70%和64.90%；接种CE处理的大叶女贞叶片胞间CO2浓度和水分利用效率均显著提高(P<0.05)，分别比对照的提高了18.72%和35.39%。在两种水分条件下，与接种灭菌菌剂的处理相比，接种AMF处理的大叶女贞叶片的水分利用效率均显著提高，特别是在干旱胁迫的环境下，提高效果更明显。虽然在两种水分条件下接种两种AMF处理的大叶女贞气体交换参数和水分利用效率的差异均不显著，但在干旱胁迫时，接种FM处理的胞间CO2浓度、蒸腾速率、水分利用效率均大于接种CE的。

图2 接种不同AMF的大叶女贞在不同水分条件下叶片气体交换参数及水分利用效率Fig.2 Leaf gas exchange parameters and water use efficiency of Ligustrum lucidum inoculated with different AMF under different water conditions

2.3 大叶女贞苗接种AMF后叶片的SPAD值及叶绿素荧光参数对干旱胁迫的响应

由表3可知：干旱胁迫对大叶女贞叶片的SPAD值影响显著(P<0.05)，使叶片的SPAD值反而增大，尤其是接种了AMF的2种处理，其SPAD值均显著增大(P<0.05)。正常供水时，接种FM和CE处理的大叶女贞叶片的SPAD值都显著(P<0.05)大于接种灭菌菌剂处理的，分别比接种灭菌菌剂处理的大6.50%和19.70%；在干旱胁迫时，接种FM和CE处理的大叶女贞叶片的SPAD值也都显著大于(P<0.05)对照处理的，分别比对照处理的大18.10%和23.74%。在干旱胁迫条件下，接种AMF显著提高(P<0.05)了大叶女贞叶片的Fv/Fm值，接种FM和CE处理的Fv/Fm值分别比接种灭菌菌剂处理的提高了1.22%和2.44%。在正常供水条件下，不同AMF接种处理的Fv/Fm差异不显著。Fv/Fm代表PSⅡ反应中心的光能转换效率，反映了植物是否受到光抑制，当植物处于逆境中或被伤害时，该指标会下降[19-20]。干旱胁迫显著降低(P<0.05)了大叶女贞叶片的qP。在干旱胁迫下，接种AMF能显著提高(P<0.05)大叶女贞叶片的qP，其中接种FM和CE处理的分别比接种灭菌菌剂处理的提高16.67%和7.14%。qP代表着PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的部分，反映PSⅡ反应中心的开放程度，qP越大，PSⅡ的电子传递活性越大[21]。干旱胁迫显著提高(P<0.05)了大叶女贞叶片的NPQ，其中，接种灭菌菌剂处理的NPQ提高最多，增量为0.56。NPQ代表PSⅡ天线色素吸收的光能以热能形式耗散的部分，反映了植物在强光环境下的自我保护机制[22]。

表3 不同处理大叶女贞叶片的SPAD及荧光参数Tab.3 SPAD and fluorescence parameters of L.lucidum under different treatments处理SPAD值PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)光化学猝灭系数(qP)非光化学猝灭系数(NPQ)W1N048.03±0.53 d0.83±0.02 ab0.55±0.05 a1.38±0.33 bcW1FM51.15±0.72 c0.84±0.01 a0.58±0.05 a1.16±0.23 cW1CE57.49±1.78 b0.84±0.01 a0.58±0.04 a1.25±0.3 cW2N049.24±0.03 cd0.82±0.02 b0.42±0.01 c1.94±0.21 aW2FM58.15±2.08 b0.83±0.01 a0.49±0.01 b1.66±0.18 abW2CE60.93±2.53 a0.84±0.01 a0.45±0.01 bc1.67±0.08 ab

3 结论与讨论

(1)干旱胁迫使紫色土上大叶女贞的叶片数显著减少，使叶面积、叶长、平均叶宽等均显著减小，使叶片相对含水量显著降低，但叶干物质含量受干旱胁迫后反而提高。干旱胁迫下，植物可通过改变叶片性状来适应环境变化，紫色土上大叶女贞通过减少叶面积来适应干旱环境。在正常供水和干旱胁迫时，接种AMF都能使大叶女贞叶片数增多，使叶片相对含水量提高，使叶面积增大。其中，接种FM对大叶女贞的叶片数增多和叶长、叶宽、叶面积增大等的促进效果都优于接种CE的。

(2)紫色土上大叶女贞在受到干旱胁迫时，其叶片净光合速率会受到抑制，接种AMF后抑制程度有所减轻。干旱胁迫显著降低了大叶女贞叶片的气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率。接种AMF显著提高了紫色土上大叶女贞的水分利用效率，特别是在干旱胁迫的环境下，促进作用更显著，且接种FM对大叶女贞水分利用效率的提升效果优于接种CE的。已有研究表明，接种AMF可以提高很多植物，如云南蓝果树(Nyssayunnanensis)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)等植物的叶片水分利用效率(WUE)[23-24]。

(3)干旱胁迫对紫色土上大叶女贞叶片叶绿素相对含量(SPAD值)的影响显著，大叶女贞叶片的SPAD值在干旱胁迫下反而增大。孔艳菊等[25]的研究结果显示，干旱胁迫下，黄栌(Cotinuscoggygriavar.cinereus)叶片中的叶绿素含量会升高，这与本研究的结论一致，可能是由于干旱胁迫使得叶片相对含水量降低，叶片扩展生长受限，叶片单位面积的叶绿素含量升高，这样虽然叶绿素含量升高了，却因水分相对含量减少又使得叶绿素的活性降低。本试验结果表明，在紫色土区的大叶女贞接种AMF后显著促进了叶绿素的合成，这与贺学礼等[26]关于柠条锦鸡儿(Caraganakorshinskii)在水分胁迫下接种AMF对其叶绿素合成的效果一致。

(4)干旱胁迫显著降低了紫色土区大叶女贞叶片的qP，但显著提高了大叶女贞叶片的NPQ。在受到干旱胁迫时，接种AMF能显著提高大叶女贞叶片的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)。这与马坤等[27]对干旱胁迫下木棉(Bombaxceiba)叶绿素荧光参数的研究结果一致。