蒲公英叶提取物对龋齿菌的抑菌活性研究

邢艳霞，祝 贺，成双双，孙天雪，杨颜菲，姚晓曼，于 洋，李 波，祝梦柳，常桂芳*，刘 瑜

（1.山东农业工程学院，山东济南 250100；2.淄博市张店区人民医院，山东淄博 255000）

蒲公英（TaraxacummongolicumHand.-Mazz.）别名婆婆丁、黄花地丁、奶汁草、华花郎等，是一种多年生菊科草本植物[1]。我国目前已经发现的蒲公英种类有75 种以上，其中药用蒲公英至少占27 种[2]，蒲公英在自然界中资源丰富，分布广泛，踪迹遍布全国各地，是我国常见的药食两用植物。蒲公英管理简单、经济收益良好；同时抗逆性强、适应性广，在我国大多地区均可人工种植[1]。蒲公英提取物及各单体成分均具有较强的生物活性。蒲公英属植物的抗菌活性物质主要包括脂肪酸中的亚油酸和亚麻酸[3]；抗炎活性主要集中于三萜类、黄酮类、酚酸类、有机酸类以及甾醇类等成分[4]；抑菌活性主要集中在黄酮、有机酸和多糖类成分[5]。蒲公英具有广谱抑菌作用，目前发现其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌和沙门氏菌都有抑菌作用[5]，但少有文章研究其对龋齿菌的抑菌作用。

近几年口腔疾病的发病率处于较高水平，全世界大约80%～90%的人有龋齿的困扰。目前，变异链球菌、远缘链球菌、口腔链球菌、牙龈卟啉单胞菌被认为是导致龋齿的主要细菌。它们借助口腔中的唾液蛋白黏附并定植在牙齿表面，从而形成牙菌斑[6]。牙菌斑中的龋齿菌可以催化水解口腔中残存的碳水化合物生成有机酸，导致牙齿中的羟基磷灰石（HA）溶解，最终形成龋洞[7]。如不及时修补，则会累及牙神经，严重影响患者的健康和生活质量。对于龋齿，人们一直在探索治愈的方法，如激光，氟制剂等。这些方法虽然有一定的效果，但长期使用可能会产生一定的毒副作用[8-9]。针对这一问题，近年来科学家研究发现许多天然产物如蒲公英叶等具有很好的防龋功效[10]，有助于改变目前难以防控和治疗龋齿的现状。本研究以蒲公英叶为原材料，探究蒲公英叶提取物对变异链球菌、远缘链球菌、口腔链球菌、牙龈卟啉单胞菌的抑制作用，并评价其抑制效果，开拓蒲公英叶在防治龋齿菌领域的研究，旨在为蒲公英叶在药用和食用方向的开发利用提供基础理论研究。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料与试剂

蒲公英鲜叶，山东腾骏祥生物科技股份有限公司。

试验选取了两种好氧菌：变异链球菌和远缘链球菌；一种兼性厌氧菌：口腔链球菌；一种严格厌氧菌：牙龈卟啉单胞菌。变异链球菌（S.mutans，ATCC25175），北京北纳创联生物技术研究院；口腔链球菌（S.oralis，ATCC 35037），北京北纳创联生物技术研究院；远缘链球菌（S.sobrinus,BNCC353916），北京北纳创联生物技术研究院；牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis，ATCCBAA-308），北京北纳创联生物技术研究院。

无水乙醇、二甲基亚砜（DMSO）、甘油，国药集团化学试剂有限公司；LB 肉汤培养基、脑心浸出液（BHI）肉汤培养基、脑心浸液琼脂（BHI）培养基、厌氧产气袋和圆形立式厌氧培养袋，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；哥伦比亚血平板，常德比克曼生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

微波干燥机，山东科弘微波能有限公司；WZJ-6J 震动式药物超微粉碎机，济南倍力粉技术工程有限公司；高压蒸汽灭菌锅，上海东亚压力容器制造有限公司；SW-CJ-1D 型（实用垂直新颖）单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；索氏提取器，郑州东亚玻璃仪器厂；RV-10 旋转蒸发仪，上海耀特设备仪器有限公司；LGL-25E 真空冷冻干燥机，四环福瑞科仪科技发展有限公司；LG10-2.4A 高速离心机，北京医用离心机厂；V-500 型可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；SPL-250 生化培养箱，上海元析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蒲公英叶预处理

将蒲公英叶摘洗干净，在80～85 ℃的水中漂烫杀青90 s，捞出后用凉水清洗，滤干水分，调整微波干燥机功率为1 200 W，转速为4 r/min，对蒲公英叶进行干燥处理。将干燥后的蒲公英叶用震动式药物超微粉碎机粉碎，分装储存。

1.2.2 蒲公英叶水溶性物质的提取

用热水浸提法提取蒲公英叶中的水溶性物质[11]。将水溶性物质干燥成粉末，并称量质量，置于4 ℃冰箱中密封储藏。按公式（1）计算提取率。

1.2.3 蒲公英叶醇溶性物质的提取

用索氏提取法提取蒲公英叶中的醇溶性物质。以70%的乙醇为提取溶剂，在94 ℃的恒温水浴锅中回流提取，直至颜色变浅，得到黄绿色的蒲公英叶醇溶性成分。用旋转蒸发仪在50 ℃下旋蒸浓缩，真空冷冻干燥24 h，将醇溶性提取物干燥成粉末，并称量质量，置于4 ℃冰箱中密封储存[12-13]。

1.2.4 供试提取液的制备

蒲公英水提物供试提取液：将水溶性提取物用无菌水配成质量浓度为1g/mL的样品溶液，以溶剂无菌水为阴性对照。

蒲公英醇提物供试提取液：将醇溶性提取物用二甲基亚砜配成质量浓度为1 g/mL 的样品溶液，以质量浓度为1 g/mL 二甲基亚砜为阴性对照。

蒲公英混合型供试提取液：将水溶性提取物与醇溶性提取物按1∶1 的比例混合，用甘油配成质量浓度为1g/mL的样品溶液，以质量浓度为1 g/mL 的甘油为阴性对照。置于4 ℃冰箱中储存备用。

1.2.5 培养基的选择

用于本次试验的龋齿菌共四种，分别为变异链球菌、远缘链球菌、口腔链球菌和牙龈卟啉单胞菌。变异链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌液体培养基用脑心浸出液（BHI）肉汤培养基，固体培养基用脑心浸液琼脂（BHI）培养基。牙龈卟啉单胞菌液体培养基用LB 肉汤培养基，固体培养基用哥伦比亚血平板。

1.2.6 龋齿菌菌悬液的制备

将不同菌种接种至液体培养基中，变异链球菌和远缘链球菌在BHI 培养基中37 ℃培养18～24 h；口腔链球菌置于BHI 培养基中37 ℃培养24～30 h；牙龈卟啉单胞菌置于BHI 培养基中37 ℃培养48～54 h。

将活化好的菌种用高速离心机在5 000 r/min 的条件下离心10 min，将上清液倒出，在沉淀的菌种中加入相应的液体培养基，测其吸光度，将吸光度调至2.0，菌悬液浓度为106～107CFU/mL，将菌种置于4 ℃冰箱中储存备用。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 抑菌作用的测定

抑菌作用的测定采用琼脂打孔扩散法[14]，在培养皿中加入龋齿菌涂抹均匀并用6 mm 的打孔器在培养皿上均匀地打4 个孔。调整样品液浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00 g/mL。培养皿中分别加入100 μL 的供试提取液和阴性对照。按照上述1.2.6 的方式培养。观察并用十字交叉法量取抑菌圈直径大小。

1.3.2 最低抑菌浓度的测定

在培养皿中加入龋齿菌涂抹均匀并用6 mm 的打孔器分布均匀地打5 个孔[15]，分别加入浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/mL 的供试提取液100 μL。按上述1.2.6 的方式培养。以没有细菌生长的最低药物浓度作为蒲公英叶提取物的最低抑菌浓度（MIC）值。

1.3.3 最低杀菌浓度的测定

采用琼脂培养基平板法[16]，取最低抑菌浓度中未见细菌生长的孔相对应的供试提取液100 μL 于培养皿中，再加入100 μL 相对应的菌液涂布均匀。按上述1.2.6 的方式培养，观察龋齿菌的生长状况。以菌落数量不超过5个的最低提取物浓度作为蒲公英叶提取物的最低杀菌浓度（MBC）值。

1.4 数据处理

所有实验重复3 次，数据以“均值±标准偏差”表示。采用单因素方差分析（ANOVA）和邓肯（Duncanny）多重比较分析数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 蒲公英叶提取物的提取率

蒲公英叶提取率如表1所示，蒲公英叶水提物的粗提率为11.9%，醇溶性提取物的粗提率为6.9%。

表1 蒲公英叶提取物提取率Table 1 Extraction rate of dandelion leaves

2.2 蒲公英叶提取物对龋齿菌的抑菌作用

2.2.1 蒲公英叶水提物对龋齿菌的抑菌作用

探究蒲公英叶水提物对四种龋齿菌的抑菌作用，用水作阴性对照。由表2 可知，当蒲公英叶的水提物浓度大于0.50 g/mL 时，对变异链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌都有抑制作用，但对牙龈卟啉单胞菌没有抑菌效果。不同浓度的蒲公英叶水提物对龋齿菌的抑菌作用有显著性差异，且抑菌效果与水溶性提取物浓度呈正相关。蒲公英叶水提物对远缘链球菌的抑菌效果更为明显，变异链球菌和口腔链球菌次之。

表2 蒲公英叶水提物对龋齿菌的抑菌圈直径Table 2 Inhibition zone diameter of dandelion leaf water extract against caries bacteria

本实验中，蒲公英叶水提物对牙龈卟啉单胞菌没有抑制作用，这与华亚南等[17]的结果一致，可能的原因如下：一是蒲公英叶水提物成分复杂，而抑菌成分少，含量低，无抑菌作用的成分大大稀释了抗菌物质的浓度，使抑菌效果无法显示，只有通过除去提取物中的非抑菌成分，提高有效抗菌物质的浓度，才能显示抑菌效果[18]；二是提取方法对蒲公英叶的抑菌作用存在一定影响。

2.2.2 蒲公英叶醇提物对龋齿菌的抑菌作用

探究蒲公英叶醇提物对四种龋齿菌的抑菌作用，用二甲基砜作阴性对照。由表3 可知，当蒲公英叶醇提物浓度大于0.25 g/mL 时，对变异链球菌、远缘链球菌有抑制作用，当浓度大于0.50 g/mL 时，对四种菌都有抑制作用。不同浓度的蒲公英叶醇提物对龋齿菌的抑菌作用有显著性差异，且抑菌效果与醇溶性提取物浓度呈正相关。蒲公英叶醇提物对变异链球菌的抑菌效果更为明显，远缘链球菌和口腔链球菌次之，对牙龈卟啉单胞菌的抑制效果相对较差。

表3 蒲公英叶醇提物对龋齿菌的抑菌圈直径Table 3 Inhibition zone diameter of dandelion leaf lipid extract on dental caries bacteria

2.2.3 蒲公英叶混合型提取物对龋齿菌的抑菌作用

探究蒲公英叶混合型提取物对四种龋齿菌的抑菌作用，用甘油作阴性对照。由表4 可知，当蒲公英叶混合型提取物浓度为0.25 g/mL 时，只对远缘链球菌有抑制作用，当浓度大于0.50 g/mL 时，对四种菌都有抑制作用。不同浓度的蒲公英叶混合型提取物对龋齿菌的抑菌作用有显著性差异，且抑菌效果与混合型提取物浓度呈正相关。蒲公英叶混合型提取物对变异链球菌的抑菌效果更为明显，之后依次是变异链球菌、口腔链球菌和牙龈卟啉单胞菌。

表4 蒲公英的混合型提取物对龋齿菌的抑菌圈直径Table 4 Inhibition zone diameter of mixed extract of dandelion on caries bacteria

蒲公英叶供试提取液浓度为0.50 g/mL 时对龋齿菌有明显的抑制作用，当浓度为0.25 g/mL 时，对部分龋齿菌有抑制作用，但0.25g/mL 浓度以下的蒲公英叶供试提取液对龋齿菌的抑制作用不明确。所以在0.50～0.10 g/mL 之间以0.10 为梯度，测蒲公英叶供试提取液的最低抑菌浓度。

2.3 蒲公英叶供试提取液的最低抑菌浓度

由表5 可知，对变异链球菌和远缘链球菌来说，蒲公英叶醇提物的抑菌效果更好，MIC 为0.20 g/mL；对口腔链球菌来说，蒲公英叶三种供试提取液的抑菌效果相似，MIC 为0.50 g/mL；对牙龈卟啉单胞菌来说，蒲公英叶醇提物和混合型提取物抑菌效果相似，MIC为0.50 g/mL。

表5 三种供试提取液对龋齿菌的最低抑菌浓度Table 5 Minimum inhibitory concentration of three extracts against caries bacteria

2.4 蒲公英叶供试提取液的最低杀菌浓度

由表6 可知，蒲公英叶醇提物对变异链球菌和远缘链球菌的杀菌效果更好，最低杀菌浓度为0.40、0.30 g/mL，对口腔链球菌和牙龈卟啉单胞菌的杀菌效果相对较差，最低杀菌浓度为0.50 g/mL。

表6 三种供试药液对龋齿菌的最低杀菌浓度Table 6 Minimum bactericidal concentration of three tested solutions to caries bacteria

3 结论与展望

本研究采用体外抑菌的试验方法，对蒲公英叶供试提取液的体外抑菌情况进行测定和分析。结果显示，蒲公英叶水提物对变异链球菌、远缘链球菌和口腔链球菌有抑菌作用，在0～1.00 g/mL 浓度内对牙龈卟啉单胞菌没有抑制作用，蒲公英叶醇提物和混合型提取物对四种龋齿菌都有抑菌作用。不同浓度的蒲公英叶供试提取液对龋齿菌的抑菌作用有显著性差异，且供试提取液浓度与抑菌效果呈正相关。蒲公英水提物对远缘链球菌的最低抑菌浓度为0.40 g/mL，蒲公英醇提物对变异链球菌和远缘链球菌的最低抑菌浓度为0.20 g/mL，蒲公英混合型提取物对远缘链球菌的最低抑菌浓度为0.30 g/mL。蒲公英水提物对远缘链球菌的最低杀菌浓度为0.40 g/mL，蒲公英醇提物对远缘链球菌的最低杀菌浓度为0.30 g/mL，蒲公英混合型提取物对四种龋齿菌的最低杀菌浓度为0.50 g/mL。最低抑菌浓度和最低杀菌浓度与抑菌圈直径数据趋于一致，说明蒲公英叶提取液对这四种龋齿菌均具有良好抑菌效果。

蒲公英粗提物虽不如单一化学药物的杀菌效果强，但绿色天然，安全无毒，来源广泛，提取工艺简单，其通过抑菌作用发挥生物活性，在抑菌领域仍然具有巨大的潜在应用价值。蒲公英作为天然药物，其化学成分复杂，各个部位含有的主要活性成分也有所不同。蒲公英叶提取物对变异链球菌、远缘链球菌、口腔链球菌和牙龈卟啉单胞菌的抗菌效果存在差异。蒲公英叶抑制致龋菌的作用是单一成分作用还是多种成分的协同作用，抑菌有效成分在体内和体外的作用是否存在差异也尚待深入研究，为下一步蒲公英类食品、药品的开发提供重要的基础理论支撑。