基于超高效液相色谱-质谱联用法的过敏煎、加味过敏煎大鼠血清差异代谢物分析*

韦 唯，谭冰燕，朱 禹，万 李，吴贤波△

1.贵州中医药大学（贵阳 550001）；2.成都体育学院（成都 610041）

过敏煎出自《祝谌予经验集》的经验方，用于治疗荨麻疹、支气管哮喘、过敏性鼻炎、湿疹等过敏性疾病[1]。“以皮治皮”源于中医“取象比类”的思想，以动植物的皮部入药治疗皮肤病，是中医药治疗皮肤病的一大特色，欧阳恒[2]、艾儒棣[3]、韩世荣[4]等教授运用此法治疗各类皮肤病并取得了良好的疗效。加味过敏煎是吴贤波教授在“以皮治皮”理论指导下，于过敏煎基础上加白鲜皮、蝉蜕组成，主要用于治疗各种过敏性疾病。

代谢组学是系统生物学的组成部分，是通过系统研究新陈代谢动态过程中代谢产物的变化规律，从而揭示机体生命活动代谢本质[5]，主要分为靶向、非靶向代谢组学。其中，非靶向分析模式能够将生物体内代谢水平的扰动情况最大程度反映出来，侧重于系统性和整体性分析。

课题组前期研究[6]发现，临床上加味过敏煎改善瘙痒症状等方面优于过敏煎（P＜0.05）；动物实验[7]也证实，加味过敏煎改善特应性皮炎小鼠模型瘙痒、皮损等方面作用明显优于过敏煎（P＜0.05）。研究结果提示，在“以皮治皮”理论指导下，加味过敏煎治疗过敏性皮肤病瘙痒症状的效果优于过敏煎。本文拟在前期研究基础上，通过非靶向代谢组的方法研究过敏煎、加味过敏煎大鼠灌胃后其血清的差异代谢物，采用生物信息学方法分析差异代谢物的种类、调控机制及功能作用等，为进一步研究加味过敏煎缓解瘙痒症状的机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

Vanquish超高效液相、Orbitrap Exploris 120高分辨质谱、Heraeus Fresco17离心机（Thermo Fisher Scientific，美国）；BSA124S-CW天平（Sartorius，德国）；JXFSTPRP-24研磨仪（上海净信科技有限公司）；明澈 D24 UV纯水仪（Merck Millipore，德国）；YM-080S超声仪（深圳市方奥微电子有限公司）；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）（沃特斯公司，美国）。

1.2 材料

甲醇 （色谱纯，CNW Technologies，德国，批号 67-56-1）；乙腈（色谱纯，CNW Technologies，德国，批号 75-05-8）；甲酸（色谱纯，Sigma，美国，批号 64-18-6）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司，批号103616-89-3）。

过敏煎、加味过敏煎处方所需的药材饮片均符合2020 版《中国药典》质控标准。防风（安国祁安药业有限公司，批号：201204）；乌梅[北京本草方源（亳州）药业科技有限公司，批号：220701]；银柴胡[北京本草方源（亳州）药业科技有限公司，批号：210401]；五味子（河北楚风中药饮片有限公司，批号：B22060702-01）；甘草[北京本草方源（亳州）药业科技有限公司，批号：220501]；蝉蜕（黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号：D22020101）；白鲜皮（北京仟草中药饮片有限公司，批号：211005001）。备齐处方中所需的药材，委托福州冻干粉制备实验室完成冻干粉制备。

1.3 动物

健康的雄性SD大鼠，SPF级，体重（200±10）g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（川）2020-030。实验大鼠适应性饲养3 d后进行正式实验。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）（沃特斯公司，美国），进样量：2 μL；分析柱保持在30 ℃，进样器样品盘15 ℃，用0.1%（v/v）甲酸水溶液（溶剂B）和乙腈（溶剂A）进行梯度洗脱。

1.4.2 质朴条件 正离子模式：电喷雾电离（electrosprayionization，ESI）；离源雾电压：3 800 V；毛细管温度：320 ℃；鞘气流速：45 Arb；辅助气流速：15 Arb；扫描范围：70～1 000 m/z；分步碰撞能量的强度取值：3；分步碰撞能量：20、40、60 eV；扫描速率均为7 Hz。负离子模式：ESI；离源雾电压：-3 100 V；毛细管温度：320 ℃；鞘气流速：45 Arb；辅助气流速：15 Arb；扫描范围：70～1 000 m/z；分步碰撞能量的强度取值：3；分步碰撞能量：20、40、60 eV；扫描速率均为7 Hz。在两种离子模式下，均进行一级（分辨率：70 000）、二级（分辨率：17 500）质谱数据采集，获取代谢原始数据。

1.4.3 血清样品采集 取SD大鼠6只，适应性喂养3 d后，随机分为过敏煎组、加味过敏煎组，每组3 只。过敏煎组以生药量72.38 g/kg作为给药剂量进行灌胃给药，加味过敏煎组以生药量81.00 g/kg作为给药剂量进行灌胃给药。早、中、晚各给药1次，连续给药3 d，末次给药前12 h禁食不禁水。分别于末次给药后60 min从大鼠腹主动脉采集血样，常温放置血样1 h，待其凝固分层后，在室温下以转速3 000 r/min，离心半径 8.6 cm，离心10 min，取上清液，4 ℃以转速12 000 r/min，离心半径8.6 cm，离心10 min，再次取上清，分装于1.5 mL离心管中，每管0.2 mL，冻存于-80 ℃冰箱中。

1.4.4 血清样品处理 将40 μL盐酸（2 mol/L）加入400 μL的血清样本中，进行1 min的涡旋混合，于4 ℃环境下静置15 min，重复该步骤4 次；随后注入1.6 mL的乙腈，进行5 min的涡旋混合，以转速12 000 r/min，离心半径8.6 cm，离心5 min，取上清1 800 μL，氮吹干燥；加入150 μL 80%甲醇（内标浓度为10 mg/L）复溶，涡旋5 min，以转速12 000 r/min，离心半径8.6 cm，离心5 min；吸取120 μL上清液，放入进样瓶中上机检测。1.4.5 数据分析 采集过敏煎血清和加味过敏煎血清在“1.4.1”项、“1.4.2”项条件下的数据。使用XCMS网站（https：//xcmsonline.scripps.edu），将质谱原始数据导入并处理。处理过程包括保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等。在鉴定含有二级碎片离子信息数据的峰的化合物时，利用上海百趣生物医学科技有限公司提供的二级质谱数据库和相应裂解规律匹配方法。

2 结果

2.1 主成分分析

对过敏煎含药血清和加味过敏煎含药血清进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。图中的1 个点代表1 个样本，蓝色点代表过敏煎含药血清，黄色点代表加味过敏煎含药血清。从图中可以看出，两组的样本分别有一定的聚集成群趋势，这说明过敏煎含药血清和加味过敏煎含药血清的代谢物存在明显差异。本次数据质量高，检测性好，所采集的数据可以进行下一步分析（图1）。

表1 差异代谢物差异倍数Top20 鉴定结果

图1 过敏煎和加味过敏煎的PCA得分图

2.2 正交偏最小二乘法-判别分析

通过SIMCA （V16.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，瑞典）软件对数据进行预处理。首先对数据进行对数转换，以及数据中心化后除以列变量标准差；然后用正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA）建模，对第一主成分进行分析，再用7折交叉验证检验模型的质量；利用交叉验证得到R2Y（模型对分类变量Y的可解释性）和Q2（模型的可预测性），然后用R2Y和Q2对模型的有效性进行评判；最后通过置换检验得到不同的随机Q2值，从而对模型的有效性做进一步检验。正离子、负离子模式下，样本在空间位置上聚类明显，分成两组，表明OPLS-DA模型稳定可靠，组间有明显差异。置换检验结果显示，置换保留度与随机模型的R2、Q2呈正比，说明模型稳健性良好，不存在过拟合现象（图2～3）。

图2 过敏煎和加味过敏煎的PCA得分图

图3 过敏煎和加味过敏煎的置换检验图

2.3 差异代谢物筛选

将差异倍数（fold change，FC）＞1.2 或＜0.83，变量投影重要度（variable mportance in the projection，VIP）＞1 且P＜0.05 作为筛选标准，筛选所得的差异代谢物为过敏煎含药血清与加味过敏煎含药血清的差异性代谢物。将样本中正、负离子模式所得到的数据合并分析后，一共筛选出差异代谢物173 个（图4）。其中，属于生物碱类代谢物的22 个，属于芳香族化合物类代谢物的4 个，属于苯丙素类代谢物的31 个，属于黄酮类代谢物的26 个，属于醌类代谢物的3 个，属于氨基酸衍生物类代谢物的2 个，属于酚类代谢物的6 个，属于脂质类代谢物的2 个，属于脂肪酰类代谢物的2 个，属于脂肪酸类代谢物的1 个，属于萜类代谢物的26 个。和过敏煎含药血清相比，有86 个上调和87 个下调代谢物存在于加味过敏煎含药血清中。通过人类代谢组数据库检索这173 个差异代谢物，从而获取生物学特性数据，并呈现前20 位差异倍数的代谢物（表1）。

图4 过敏煎和加味过敏煎的差异代谢物火山图

2.4 代谢通路分析

将鉴定出来的173 个差异代谢物提交至MetaboAnalyst 5.0 进行通路分析，将过敏煎含药血清与加味过敏煎含药血清样本中显著性的差异代谢物注释到10条代谢通路中（表2、图5）。图中横轴表示通路的拓扑分析，纵轴表示通路的富集分析（P），节点颜色越深表示P值越小，节点半径越大表示impact越大。根据P＜0.05且impact＞0，最后共筛选出2条通路：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路以及维生素B6 的代谢通路。酪氨酸为富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路上的差异氨基酸，吡哆醇为富集在维生素B6代谢通路上的差异生物碱（表3）。

表2 差异性代谢物涉及的代谢通路

表3 2 条代谢通路所匹配的差异代谢物

图5 差异代谢物的相关代谢通路

3 讨论

过敏煎由防风、乌梅、五味子、银柴胡、甘草组成。防风辛温，解表散风胜湿强，善行皮毛与经脉之气；乌梅酸收性平，既可收敛肺气，亦可温养肌肤；银柴胡味甘辛凉，疏风散邪，清邪壅郁热，透热凉血；五味子酸甘而温，益气敛肺，补肾养阴。药理学研究[8]表明，防风、乌梅、五味子、银柴胡4 味单药均具有抗过敏的作用[7]；甘草性平，一可补脾益气，二能调和诸药。五味药共奏祛风解表，扶正祛邪之功。加味过敏煎在过敏煎的基础上增加了白鲜皮、蝉蜕，白鲜皮为芸香科植物白鲜的干燥根皮，能够清热解毒、祛风除湿止痒，药理学研究[9]表明其有抗菌、抗炎与抗变态反应等作用。蝉蜕是蝉科昆虫蚱蝉羽化时蜕下的壳，其体轻浮，善走皮腠，可疏散风热、透疹、祛风止痉、治瘾疹，药理研究[10]表明，蝉蜕具有抗惊厥、抗炎、免疫抑制及抗过敏等作用。二者均为动植物的皮部药，二皮共用意在“以皮治皮”，增强祛风止痒之效。加味过敏煎的7 味药共奏祛风止痒除湿、养阴润燥生津之功。

本实验基于非靶代谢组学技术分析大鼠灌胃过敏煎、加味过敏煎复方后，其血清中代谢物的变化，采用PCA、OPLS-DA、聚类分析等方法识别大鼠血清样本数据变化模式。根据PCA和OPLS-DA结果可知，不同处理样本点分布明显分离，表明过敏煎和加味过敏煎含药血清中的代谢物存在明显差异。根据FC＞1.2 或＜0.83，VIP＞1 且P＜0.05 为筛选标准筛选出差异代谢物173个，将这173个差异代谢物用MetaboAnalyst 5.0进行通路富集分析，分析结果显示，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成与维生素B6代谢这两条通路可作为加味过敏煎治疗效果区别于过敏煎的主要代谢通路，酪氨酸、吡哆醇分别为这两条通路所匹配的代谢物。

酪氨酸为氨基酸的衍生物，其与苯丙氨酸、色氨酸一同属于芳香族氨基酸。芳香族氨基酸是人体内许多重要生物化合物的前体，其中，酪氨酸与神经元的传递关系密切，是一种神经递质前体[11]。除了作为神经递质的前体，酪氨酸还可被专门的蛋白激酶磷酸化[12]。酪氨酸磷酸化是调节酶活性和信号转导的主要步骤。研究[13]指出，酪氨酸和FcεRIβ之间的相互作用对于肥大细胞活化至关重要；研究[14]提出，酪氨酸与小鼠模型中严重的过敏性哮喘有关，并且是高表达的血液嗜酸性粒细胞的关键分子；而研究[15]提出，酪氨酸的微生物代谢可防止气道过敏性炎症。以上研究说明酪氨酸对信号通路可能具有双向调节作用。

映射在维生素B6 代谢通路上的差异代谢物有1 个，即吡哆醇。吡哆醇是具有维生素B6 作用的物质之一，在维持表皮功能方面起着重要作用，目前多用于治疗痤疮和皮肤粗糙。特应性皮炎与角质形成细胞的异常相关，角质形成细胞的异常可使丝聚蛋白的表达下降，进而影响表皮的分化、角化、破坏皮肤屏障功能，促进特应性皮炎的产生[16]。调节丝聚蛋白的表达被认为是治疗和预防特应性皮炎的一种前瞻性策略。研究[17]发现，吡哆醇可增加正常人表皮角质形成细胞中丝聚蛋白的表达和产生，这表明吡哆醇是一种有益的化合物，有利于防止特应性皮炎的恶化和复发。

综上所述，本研究从过敏煎、加味过敏煎的含药血清中发现酪氨酸和吡哆醇2 个差异代谢物。结合课题组的前期研究分析，加味过敏煎在临床改善瘙痒症状等方面、在动物实验中改善特应性皮炎小鼠模型瘙痒、皮损等方面作用明显优于过敏煎，可能与差异代谢物酪氨酸和吡哆醇有关，具体机制还需进一步实验验证。