基于实验及网络药理学探讨芍药甘草汤治疗子宫腺肌病的机制

邝梓君，卢 洁，贾金金，曾 诚，韩 慧，李佩琼，曾玉燕*

1.佛山市第一人民医院，广东 佛山 528000；2.广州中医药大学 广东 广州 510405；3.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；4.广东省中医院，广东 广州 510120

子宫腺肌病（adenomyosis, AM）是指具有活性的子宫内膜腺体和间质侵入正常的子宫肌层，形成弥漫性或局限性的病变，进而引起渐进性痛经、月经过多、不孕等临床表现，严重影响患者的身心健康[1]。 AM 在育龄期女性中的发病率为7%～23%，且逐渐年轻化[2]。 该病发病机制复杂，与子宫内膜基底部内陷及组织损伤修复、子宫肌层内的胚胎多能干细胞化生、炎症刺激、上皮-间质转化、血管生成、遗传、免疫反应等机制相关[2]。 其根治性方法是行子宫全切除术，但考虑到年龄、生育要求等因素，该方法只适用于少数患者。 而非甾体抗炎药、孕激素类药物、促性腺激素释放激素激动剂等药物治疗可缓解患者临床症状，但临床疗效短暂，具有一定毒副作用，停药后容易复发。

AM 归属于中医学“月经过多”“痛经”“癥瘕”“不孕”等疾病范畴。 中医药对缓解AM 相关症状，尤其是缓解疼痛方面疗效显著，可控制病灶，不影响患者的生育需求[3]。 芍药甘草汤出自《伤寒杂病论·辨太阳病脉证并治》，以芍药为君、甘草为臣，仅此二药配伍而成，组方精简，具有养血敛阴、调和肝脾、缓急止痛之功效。 现代药理学和临床研究表明，芍药甘草汤具有显著的解痉镇痛等作用[4-5]，常用于治疗痉挛性、疼痛性、炎症性疾病以及妇科疾病等[6]。本研究旨在探讨经典名方芍药甘草汤对AM 间质细胞的影响，并通过网络药理学研究进一步发掘芍药甘草汤治疗AM 可能涉及的分子作用机制。

1 实验研究

1.1 主要试剂

DMEM（武汉Servicebio 生物科技有限公司，批号：G4510）；澳洲胎牛血清、胰酶+酚红+0.25%EDTA（美国GIBCO 公司，批号分别为：10099-141、25200056）；胶原酶Ⅰ型（美国Sigma 公司，批号：C0130）；广谱细胞角蛋白抗体、波形蛋白抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为：ZM-0069、ZM-0260）；酶标羊抗鼠/兔IgG 聚合物（上海Gene Tech 公司，批号：GK500505A）；青霉素-链霉素溶液（双抗，100×）（武汉Procell 公司，批号：PB180120）；PBS 缓冲液（1X）（Biosharp 公司，批号：BL302A）；MTT（美国MCE公司，批号：HY-15924）；Annexin V-APC/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技有限公司，批号：KGA1026）；二甲基亚砜（DMSO）（美国MP 公司，批号：196055）。

1.2 主要仪器

CO2恒温培养箱[上海一恒科学仪器有限公司，型号：BPN-150CH（UV）]；倒置显微镜（广州Mshot科技有限公司，型号：MF52-N）；台式低速离心机、台式高速离心机（湖南可成仪器设备有限公司，型号分别为：L3-5K、H1-16K）；恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司，型号：HH-2）；流式细胞仪（美国BECKMAN公司，型号：CytoFLEX）；酶联免疫分析仪（山东BIOBASE 公司，型号：BK-EL10C）。

1.3 标本取材

实验所需人体组织取自2020 年9 月至2021 年12 月于广东省中医院妇科住院并要求行全子宫切除手术治疗的AM 痛经患者共10 例。 子宫离体后，在无菌条件下解剖子宫，取较硬处病灶3 cm×3 cm×2 cm。该实验通过广东省中医院伦理委员会同意（伦理审批号：BF-2020-123-01）。

1.4 实验方法

1.4.1 AM 原代细胞培养及细胞鉴定 标本用无菌眼科剪碎组织至1 mm×1 mm×1 mm，加入Ⅰ型胶原酶，为组织体积2～3 倍。 置于37 ℃恒温水浴箱中消化4～6 h 后终止消化，以100 目滤网过滤后400 目复滤，留取滤出的混悬液，置于离心机以1 000 r/min离心10 min（离心半径62.5 mm），共2 次，弃上清液，向装有沉淀物的离心管中加入含10%FBS 的DMEM 细胞完全培养基4 mL，以5×105种植至25 cm×25 cm的细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。48 h 后第1 次换液，之后视细胞生长情况3～5 d 换液1 次，在细胞生长融合达到80%～90%时，进行细胞传代培养，取第2～3 代细胞进行实验。 免疫细胞化学染色法（immunocytochemistry, ICC）以波形蛋白抗体、角蛋白抗体对AM 间质细胞进行染色鉴定。

1.4.2 芍药甘草汤水煎液药物制备 购置白芍180 g、甘草72 g（购于广东省中医院中药房，批号分别为2111005、G042171），药材分别碎成粉末状，再次配比，8 倍量蒸馏水煮沸10 min，转文火煮50 min。在80 ℃下浓缩至流浸膏状，定容至1 mL 含生药0.3 g的芍药甘草汤水煎液。

1.4.3 含药血清的制备 根据含药血清剂量不同，分为：正常血清组，芍药甘草汤低、中、高剂量组。 大鼠的给药剂量按《药理实验方法学》[7]标准动物的等效剂量折算系数的5 倍。 芍药甘草汤低、中、高剂量分别为1.15×103、2.31×103、4.62×103mg/（kg·d）。 含药血清制备方法参照课题组前期研究[8]：将上述浓度配制后，每只大鼠灌胃2 mL，正常血清组予等量的生理盐水。早晚各1 次，间隔12 h，共3 d。第3 天给药时禁食不禁饮，最后1 次给药1 h 后对大鼠进行腹主动脉取血，血清在室温静置1 h，离心、分离，同组血清混匀，56 ℃水浴30 min 作灭活处理，0.22 μm 微孔滤膜除菌，所得血清分装保存于－80 ℃冰箱备用，避免反复冻融。

1.4.4 MTT 法检测细胞增殖 取对数期生长的AM间质细胞种植于96 孔版中，每孔约1×104个细胞。分为以下5 组：空白组（AM 原代细胞），正常血清组（AM 原代细胞+正常血清），AM 原代细胞+芍药甘草汤含药血清低、中、高剂量组，各组依次培养，干预24 h、48 h 之后换成完全培养基100 μL，每孔加入MTT 溶液10 μL，CO2培养箱中继续培养2 h，吸出培养基，加入150 μL DMSO 震荡10 min，酶标仪上以570 nm 波长检测各孔吸光度（OD），计算细胞增殖率，筛选出效果更显著的干预时间继续下一步的实验步骤。 细胞生长增殖率（%）=（用药组OD-空白组OD）/（正常血清组OD-空白组OD）×100%。

1.4.5 细胞划痕检测细胞迁移水平 取对数期生长的AM 间质细胞，分组同“1.4.4”。 根据MTT 实验结果筛选出干预时间为48 h。 马克笔在6 孔板背后，均匀地划横线，横穿过孔；以1×106个/孔接种于细胞培养6 孔板，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养过夜；待细胞密度达到90%以上，铺满6 孔板底部，用枪头垂至于背后的横线划痕；用PBS 洗涤细胞3次，去除划下的细胞，加入对应血清，同时拍取照片；放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养，拍取48 h照片。

1.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期、生长状态良好的AM 细胞，分组同“1.4.4”。 以5×105个/孔接种于细胞培养6 孔板，分别加入对应血清，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，胰酶消化收集细胞，用PBS 将细胞润洗2 次，1 200 r/min，5 min离心（离心半径62.5 mm），加入500 μL Binding Buffer，重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-APC混匀后加入5 μL 7-AAD，混匀，室温避光反应5～15 min，流式细胞仪上机检测，计算细胞凋亡率。

1.5 统计分析

2 网络药理学分析

2.1 数据库与软件

TCMSP 数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php），Pub-Chem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），Swiss-ADME网络数据库（http://www.swissadme.ch/index.php），Swiss Target Prediction 网络数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），GeneCards 数据库（http://www.genecards.org/），STRING 数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl），Metascape 数据库（http://metascape.org/gp/index.html），微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/），易汉博生物信息在线作图（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.html），网络拓扑属性分析软件Cytoscape3.6.0。

2.2 芍药甘草汤活性成分的筛选

将“白芍”“甘草”作为Herd name 输入TCMSP数据库，检索其化学成分，并根据文献进行补充。在TCMSP 数据库设置口服生物利用度（oral bioavaila bility, OB）≥30%及类药性（druglikeness, DL）≥0.18，获得白芍和甘草的主要活性成分。根据文献补充的化合物以“经胃肠可吸收度=‘HIGH’，DL≥2 个‘YES’”为条件在SwissADME 数据库进行筛选。

2.3 药物作用靶点的预测及疾病靶点的获取

经过上述方法筛选获得芍药甘草汤的主要活性成分后，通过PubChem 数据库获得其Canonical SMILE结构，并输入Swiss Target Prediction 网络数据库进行主要活性成分的靶点预测分析，提取可能性大于0的作用靶点。 把“adenomyosis”作为检索词在GeneCards数据库获得AM 的相关靶点。

2.4 药物-活性成分-关键靶点网络的构建

将疾病靶点与药物作用靶点取交集，得到芍药甘草汤治疗AM 的关键靶点。 借助在线制作工具Draw Venn Diagram 绘制韦恩图。 利用Cytoscape 3.6.0 软件构建“药物-活性成分-关键靶点”网络并进行网络拓扑异构学分析，寻找芍药甘草汤治疗AM 的重要活性成分和靶点。

2.5 靶点蛋白相关互作网络的构建

采用STRING 数据库对芍药甘草汤治疗AM 的关键靶点进行蛋白质相互作用分析，并借助Cytoscape 3.6.0 对蛋白互作关系进行可视化分析，以节点度值（Degree）、中介中心度（Betweenness Centrality）、紧密中心性（Closeness Centrality）等作为筛选指标，首先以“Degree≥中位数”作为筛选条件进行第一次靶点提取分析，随后以“Degree、Betweenness Centrality、Closeness Centrality≥中位数”作为筛选条件进行第2 次靶点提取分析，逐步筛选出芍药甘草汤治疗AM的核心靶点。 利用Metascape 数据库，依据分子复合物检测算法（molecular complex detection, MCODE）对关键靶点的PPI 网络进行模块分析及功能注释。

2.6 关键靶点GO 和KEGG 通路富集分析

借助Metascape 数据库对芍药甘草汤治疗AM的关键靶点进行基因功能GO 富集分析和KEGG 通路分析，选择P＜0.01，最小计数3，富集因子＞1.5 的基因功能群分别进行分子功能、生物过程、细胞组成以及KEGG 通路进行分析。 同时，利用在线作图工具微生信平台及易汉博生物信息在线作图构建GO富集分析柱状图和KEGG 通路信息图。

3 结果

3.1 原代细胞培养及鉴定

在提取原代细胞48～72 h 后，显微镜下观察部分细胞可贴壁。 培养过程中AM 间质细胞呈典型梭形生长，相互平行排列，活力较好。 细胞冻存复苏后细胞活性稳定，形态大致与原代细胞相同。ICC 结果显示， 间质细胞标志性蛋白波形蛋白成强阳性表达，而上皮细胞标志性蛋白角蛋白呈阴性表达，说明细胞活性和纯度均较高，可用于后续实验研究。详见图1。

图1 AM 间质细胞图（ICC×100）

3.2 芍药甘草汤对AM 间质细胞增殖率的影响

与干预24 h 后比较，干预48 h 后芍药甘草汤含药血清低、中、高剂量各组细胞增殖率均降低（P＜0.05），提示48 h 抑制细胞增殖率明显强于24 h，效果呈时间依赖性，故筛选出48 h 干预时间的细胞进行后续实验。 与空白组、正常血清组比较，干预24 h后芍药甘草汤含药血清中、高剂量组细胞增殖率降低（P＜0.05），干预48 h 后芍药甘草汤含药血清低、中、高剂量组细胞增殖率降低（P＜0.05）。与芍药甘草汤含药血清低剂量组比较，干预48 h 后芍药甘草汤含药血清中、高剂量组细胞增殖率降低（P＜0.05）；与芍药甘草汤含药血清中剂量组比较，芍药甘草汤含药血清高剂量组细胞增殖率降低（P＜0.05）。详见表1。

表1 芍药甘草汤含药血清对AM 间质细胞增殖率的影响（±s）

表1 芍药甘草汤含药血清对AM 间质细胞增殖率的影响（±s）

注：A.空白组；B.正常血清组，C、D、E 组分别为芍药甘草汤含药血清低、中、高剂量组。 与24 h 比较，#P＜0.05；与空白组比较，*P＜0.05；与正常血清组比较，※P＜0.05；与芍药甘草汤含药血清低剂量组比较，△P＜0.05；与芍药甘草汤含药血清中剂量组比较，▲P＜0.05。

分组24 h OD 值增殖率/%48 h OD 值增殖率/%ABCDE 0.65±0.03 0.64±0.01 0.61±0.02 0.53±0.02 0.48±0.02 1.00 0.98±0.05 0.93±0.02 0.81±0.06*※0.72±0.06*※0.88±0.03 0.86±0.01 0.75±0.01 0.67±0.03 0.54±0.02 1.00 0.97±0.05 0.84±0.02*※#0.75±0.03*※#△0.58±0.04*※#△▲

3.3 芍药甘草汤对AM 间质细胞迁移的影响

与空白组、正常血清组比较，干预48 h 后芍药甘草汤含药血清低、中、高剂量组细胞迁移距离均缩短（P<0.05）。与芍药甘草汤含药血清低剂量组比较，干预48 h 后芍药甘草汤含药血清中、高剂量组细胞迁移距离缩短（P＜0.05）；与芍药甘草汤含药血清中剂量组比较，芍药甘草汤含药血清高剂量组细胞迁移距离缩短（P＜0.05）。 详见表2、图2。

表2 芍药甘草汤含药血清对AM 间质细胞迁移的影响

图2 细胞划痕实验（ICC×100）

3.4 芍药甘草汤对AM 间质细胞凋亡的影响

与空白组、正常血清组比较，干预48 h 后芍药甘草汤含药血清低、中、高剂量组细胞凋亡率升高（P<0.05）。与芍药甘草汤含药血清低剂量组比较，干预48 h 后芍药甘草汤含药血清中、高剂量组细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与芍药甘草汤含药血清中剂量组比较，芍药甘草汤含药血清高剂量组细胞凋亡率升高（P＜0.05）。 详见表3、图3。

表3 芍药甘草汤含药血清对AM 间质细胞凋亡的影响

图3 流式检测细胞凋亡实验

3.5 芍药甘草汤活性成分及靶点的筛选

根据TCMSP 数据库，共获得白芍化合物85 个，甘草化合物92 个。 根据文献报道，补充了白芍化合物36 个。 但限于OB、DL、胃肠可吸收度等条件及Pubchem、Swiss Target Prediction 数据库的筛选，最终得到白芍化合物21 个、甘草化合物86 个，二者共有化合物3 个，分别为白桦脂酸、谷甾醇、山柰酚。通过Swiss Target Prediction 数据库的预测，共获得芍药甘草的作用靶点共822 个。 以“adenomyosis”作为检索词在GeneCards 数据库检索得到AM 的相关靶点294 个。 二者进行交集，并制作韦恩图，详见图4。得到芍药甘草汤治疗AM 的关键靶点58 个，涉及98 个中药成分，约占总活性成分95%。

图4 疾病与药物靶点的韦恩图

通过Cytoscape 3.6.0 构建“药物-活性成分-关键靶点”网络并行性网络拓扑异构学分析，详见图5。该网络图包含158 个节点、917 条边，其中绿色三角形节点代表中药，五边形橙色节点代表活性成分，圆形红色节点代表关键靶点。 Degree 值越大，则节点面积越大，颜色越深。根据Degree 值排名，前十的化学成分甘草宁G（Gancaonin G）、鳞叶甘草素A（Glepidotin A）、刺果甘草查尔酮（Glypallichalcone）、Kanzonol F、8α-羟基甘草次酸（18α-hydroxyglycyrrhetic acid）、白藜芦醇（Resveratrol）、苜蓿毒素（Medicarpin）、7-甲氧基-2-甲基异黄酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、山柰酚（kaempferol）、异三醇（Isotrifoliol）。 排名前十的靶点为雌激素β 受体（estrogen receptor β,ESRβ）、雌激素α受体（estrogen receptor α,ESRα）、P450芳香化酶基因（cytochrome P-450AROM, CYP19A1）、17-β-羟基类固醇脱氢酶2 型（17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2, HSD17B2）、表皮生长因子（epidermal growth factor receptor, EGFR）、基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1, MMP-1）、多不饱和脂肪酸5-脂氧合酶（polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase, ALOX5）、基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3, MMP-3）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）。详见表4。

表4 Degree 排名前十的活性成分及关键靶点信息

3.6 靶点蛋白相关互作网络的构建与分析

利用STRING 数据库对芍药甘草汤的作用靶点进行蛋白质相互作用分析， 获取其蛋白质相互作用关系，借助Cytoscape3.6.0 构建PPI 网络。 该网络包含58 个节点，相互关系440 条，Degree 值中位数为12。以“Degree≥12”为条件筛选提取核心网络，进行网络拓扑异构学分析，计算得到Degree、Betweenness Centrality、Closeness Centrality 中位数后，以“Degree≥16，Betweenness Centrality≥0.006 782 9，Closeness Centrality≥0.681 818 18”作为条件，进行第2 次核心网络的提取，过程如图6。最终得到PPI 网络含有13 个节点，包括血管生长内皮因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、EGFR、MMP-9、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（serine/threonine-protein kinase mTOR,mTOR）、细胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin-D1,CCND1）、前列腺素内环氧化物合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2）、MMP-2、RAC-α 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase, AKT1）、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、纤维母细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2,FGF-2）、ESR1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）、孕激素受体（progesterone receptor, PGR）是芍药甘草汤治疗AM 的核心靶点。

3.7 分子复合物检测

通过Metascape 数据库的MCODE 算法对关键靶点的PPI 网络进行模块预测，结果显示靶蛋白中有功能相似的蛋白复合物，K-core 值>3 的共有5个。 每个模块中的蛋白有着紧密的联系，协同参与调控某条信号通路、某项生物过程或某种分子功能。 各模块蛋白聚集的生物过程和通路分析。 详见表5。

表5 芍药甘草汤关键靶点PPI 网络MCODE 模块分析

3.8 GO 基因富集分析

利用Metascape 数据库对关键靶点进行GO 富集分析，筛选P<0.01，最小计数3，富集因子>1.5 的条目，显示芍药甘草汤治疗AM 涉及1 164 个生物过程、50 个细胞组成、69 个分子功能。 根据P 值排名，生物过程、细胞组成和分子功能各前二十的富集条目，详见图7。 结果提示芍药甘草汤治疗AM 主要参与细胞迁移、细胞运动、细胞成分运动的正调控，上皮细胞增殖、血管发育、腺体发育等生物过程，调控发挥核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、趋化因子结合、雌激素受体活性等分子功能，涉及核膜、细胞外基质、细胞体、轴突、神经元细胞体等细胞组成。

图7 芍药甘草汤GO 富集分析

3.9 KEGG 通路分析

A

利用Metascape 数据库对关键靶点进行GO 富集分析，筛选P<0.01、最小计数3、富集因子>1.5 的条目，共得到130 条。 根据P 值排名，前二十名通路详见图8。 以癌症居多，包括癌症通路、癌症的微小RNA、前列腺癌、胃癌、癌症中的转录失调、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、膀胱癌等，提示芍药甘草汤可能具有潜在的抗癌治疗作用，有待进一步验证。 在富集的条目中，芍药甘草汤治疗AM 可能涉及的通路主要包括内分泌抵抗、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B 信号（Phosphatidylinositol 3-kinase-RAC serine/threonine-protein kinase, PI3K-Akt）信号通路、局部黏附、缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1,HIF-1）信号通路、雌激素信号通路、类固醇激素生物合成、丝裂原活化蛋白激酶信号（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路、卵巢类固醇生成等，这些通路主要与血管生成、炎症反应、细胞增殖、细胞迁移侵袭、细胞凋亡、性激素合成代谢等相关。

图8 芍药甘草汤KEGG 通路富集分析

4 讨论

AM 发病率逐年增高，其中15%～30%的患者痛经，AM 也可导致继发性不孕、早期流产[9]等，给患者造成极大的心理负担。 中医学认为AM 的根本病机是机体气血失和，脏腑功能失调、冲任损伤，致部分经血不循常道而逆行，“离经”之血瘀积，蓄积胞宫，瘀滞日久则为癥瘕[10]。芍药甘草汤是缓急止痛名方，方中白芍具有养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳功效；甘草补益脾气、清热解毒、缓急止痛、调和诸药。临床上芍药甘草汤常用于治疗颈肩腰腿痛证、消化性溃疡、三叉神经痛等多种痛症[11]。 郑仁省等[12]研究结果提示，芍药甘草汤治疗痛经可有效改善临床症状，降低炎症指标，缓解疼痛。 现代药理学研究证实，芍药甘草汤具有抗炎镇痛、神经保护、解痉镇痛等作用[13]。本研究表明，芍药甘草汤含药血清能显著抑制AM间质细胞的增殖、迁移，促进AM 间质细胞凋亡，疗效呈浓度和时间依赖性，其中以高浓度芍药甘草汤含药血清干预48 h 效果最好。

结合实验结果及网络药理学结果，本课题组认为芍药甘草汤是通过MMP、EGFR、CCND1、HIF-1、PI3K-Akt 信号通路等多成分、多靶点、多信号通路的相互作用，抑制AM 间质细胞增殖、迁移、促进细胞凋亡，干预AM 的发生发展，缓解痛经。MMP 是降解和重建细胞外基质的重要蛋白酶，它可以通过蛋白质水解法降解细胞外基质的各种成分，使细胞能够入侵组织。研究证实，MMP-9、MMP-2 在AM 患者中显著表达，且与VEGF 的表达呈正相关，MMP-9、MMP-2 的高表达促进了子宫内膜细胞的迁移、侵袭的过程以及血管生成过程[14]。 EGFR 是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性。 当EGFR内在蛋白激酶被激活，形成磷酸化的EGFR 后，可参与多种下游信号通路调控细胞的增殖、抑制细胞凋亡、诱发肿瘤血管产生、增强肿瘤细胞的迁移和侵袭。 磷酸化信号传导与转录激活因子3（phospho-signal transducer and activator of transcription 3, p-STAT3）是位于EGFR 下游的细胞质转录因子，能促进内皮细胞的迁移及微血管的形成，降解肿瘤基底膜和细胞外基质，降低细胞间黏附能力，以此来促进肿瘤细胞的侵袭和转移。 EGFR、STAT3 在AM 在位内膜及异位内膜中的表达均高于正常内膜组。 研究证实，加味芍药甘草汤可抑制EGFR 和p-EGFR，使其下游STAT3 和p-STAT3 的表达下降，从而抑制AM细胞的迁移和增殖[15]。EGFR 与VEGF 受体VEGFR具有的共同下游信号通路PI3K/AKT/mTOR 与血管生成，细胞增殖、生长、转移和黏附相关。Akt1 参与调节细胞代谢、增殖、凋亡和血管生成等。PI3K-Akt信号通路参与多种生长因子、细胞因子和细胞外机制的信号转导，并可调控细胞增殖、分化、凋亡、存活等生物过程[16-17]。mTOR 是Akt 下游的一个重要作用靶点，介导细胞内外多种信号对细胞代谢、生长、增殖等重要生命活动的调节[18-19]。PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活促进了AM 病灶细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成[20-21]。 此外，局灶黏附与细胞的增殖、生长、迁移有关，该信号中的重要启动因子局部黏着斑激酶被证实在AM 患者的在位内膜中高表达，其下游通路有MAPK 信号通路和PI3K-Akt 信号通路，共同调节细胞与细胞外基质的黏附，促进内膜细胞向肌层侵入，形成异位内膜病灶[22-23]。人类CCND1 基因位于11 号染色体长臂上，其编码的细胞周期蛋白cyclin D1 是细胞周期从G1-S 过度的关键调控因子，主要通过细胞增殖途径参与肿瘤的形成[24]。最新研究表明，采用PI3Kα 抑制剂BYL719 或mTOR 抑制剂everolimus 靶向抑制PI3K/mTOR 信号通路相关因子的表达可下调cyclin D1 蛋白水平[25]。 Cyclin D1过表达主要与周期蛋白依赖性蛋白激酶4（cyclindependent kinase4, CDK4）或CDK6、CDK2 结合成复合物，加快细胞通过G1 检查点，具有推动细胞周期进程的作用，与异位子宫内膜的异常生长、增殖、浸润、转移及复发等恶性生物学表现有关[26]。 研究发现，AM 作为一种雌激素依赖性疾病，雌激素受体过度激活可以下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和上调细胞周期蛋白依赖性激酶、cyclin D1、CDK2、CDK2、CDK6，参与AM 的发生过程[27]。HIF-1 在AM 组织中也存在高表达，被认为从血管生成、细胞侵袭等方面参与了AM的发生发展过程[28-30]，但具体机制研究较少。 AM 与子宫内膜异位症在发病过程、症状、治疗均有相似之处。 在子宫内膜异位症中，HIF-1α可上调异位内膜基质细胞中转化生长因子-β1（transforming growth factor beta-1 proprotein, TGF-β1）的分泌，激活TGF-β1/母体抗生物皮肤生长因子同源物（transforming growth factor beta-1 proprotein/mothers against decapentaplegic homolog, TGF-β1/Smad）信号通路，从而促进整合蛋白表达，增强异位子宫内膜间质细胞的黏附能力[31]。 此外，HIF-1α 表达激活了β-连环蛋白/T 细胞因子（β-catenin/T-cell factor）信号通路，诱导VEGFR 和MMP-9 的表达[32]，HIF-1α可以通过诱导自噬从而触发上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）[33-34]， 促进异位子宫内膜细胞的迁移和侵袭能力。 以上机制也可能促进AM 的发生。

综上分析，芍药甘草汤可能通过干预MMP-9、MMP-2、VEGF、EGFR、CCND1、局部黏着斑激酶、HIF-1 等多个靶点的表达，及调控以上靶点与PI3K/Akt/mTOR、HIF-1、MAPK 等多个信号通路的相互作用，从而抑制AM 细胞的增殖、迁移和血管生成从而发挥治疗效果。

此外，网络药理学研究结果提示，芍药甘草汤可能通过调控类固醇激素和抗炎镇痛等机制治疗AM。 课题组前期研究证明，AM 组织中雌激素及受体表达水平升高，且通过雌激素激活及剥夺状态证实雌激素及其受体可促进AM 病灶细胞增殖[35]。 后续实验也证实，以芍药、甘草为主的中药复方及其含药血清均能明显降低细胞雌激素受体水平，并通过干预雌激素受体与miR-21 介导的Ras/Raf 通路形成的信号交通网，对AM 痛经患者起治疗作用[36-37]。

5 结语

本研究证实了芍药甘草汤含药血清通过抑制间质细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡发挥治疗作用，并通过网络药理学分析芍药甘草汤治疗AM 的主要活血成分、关键靶点及可能涉及的分子机制，体现了AM 发病机制的复杂性以及中药复方芍药甘草汤“多成分-多靶点-多途径”的药物特点，课题组下一步将对主要调控的靶点进行实验验证，并通过其进行靶向调控等实验，并探索具体的分子机制。