补肝健膝方对膝骨关节炎模型兔COMP、CTX-Ⅱ及炎性指标的影响

叶子丰，戎 宽，匡建军，仇湘中，许 辉*

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；3.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410006

膝骨关节炎（knee osteoarthritis, KOA）是多由于关节软骨及关节软骨下骨出现病理改变，导致关节软骨出现破坏、变性、骨质增生为主要特征的慢性退行性变[1-3]。目前，KOA 的发病机制依然存在争议，进行性关节滑膜炎导致的软骨损失是KOA 病情进展不可忽视的因素[4-7]。 白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）为一种重要的炎性介质，其表达水平升高可导致滑膜炎症反应发生，同时介导软骨破坏，在KOA发生展过程中起着重要作用；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）是一种主要由单核巨噬细胞生成的促炎因子，其可通过诱导破骨前体细胞增殖、分化而参与KOA 患者软骨破坏吸收过程[8]。软骨寡聚基质蛋白（cartilage oligomeric matrix protein, COMP）是一个较为复杂的细胞外基质蛋白集团，有研究表明，COMP 水平的变化可加重膝关节软骨损伤程度，是评价关节软骨损害的指标之一[9]。 而Ⅱ型胶原C 端肽（C-telopeptide of type Ⅱcollagen,CTX-Ⅱ）的严重丢失是造成KOA 的主要原因，其Ⅱ型胶原羟基端交联肽在成熟过程与软骨的降解关系密切[10]。目前，对KOA 的治疗中，西医治疗大多以口服非甾体抗炎镇痛药、关节腔注射玻璃酸钠以及糖皮质激素为主，药物作用持续时间短，毒副作用大[11]。随着近年来中医事业的发展，中医药防治KOA 逐渐成为重要手段，具有疗效可靠、不良反应少等优点[12]。补肝健膝方由全国名老中医药仇湘中教授以《医宗金鉴·卷七十七》中的“补肝汤”为基础方，结合膝痹“肝虚络痹”的病证特点加减而成，并在既往临床试验中证明该方在KOA 防治中疗效确切[13-14]，但具体作用机制尚未明确。 本实验通过研究补肝健膝方对KOA 兔软骨组织及血清IL-1、TNF-α、COMP 和CTX-Ⅱ含量表达的影响，探索其作用机制，以期为中医药防治KOA 提供新思路。

1 材料

1.1 实验动物

30 只健康5～7 月龄雄性新西兰大白兔由湖南省中医药研究院动物实验中心提供，体质量（2.0±0.5） kg，许可证号：SCXK（湘）2018-0009。 于湖南省中医药研究院开放式动物房动物饲养室中喂养，温度18～25 ℃，相对湿度50%～70%，单笼饲养，标准营养饲料喂养，自由饮水、摄食，每日清洗笼舍。所有动物管理和协议均获得湖南省中医药研究院实验动物管理和使用委员会的批准（伦理号：2022040734）。

1.2 药物

（1）补肝健膝方由湖南省中医药研究院附属医院药剂科提供，药物组成：白芍30 g，牛膝15 g，桂枝12 g，生地黄15 g，白芷10 g，僵蚕l0 g，泽泻10 g，车前子10 g，熟地黄25 g，当归l0 g，木瓜15 g，炒麦芽10 g，桑枝15 g，蜈蚣1 条，甘草5 g。 （2）独活寄生汤由湖南省中医药研究院附属医院药剂科提供，药物组成：白芍15 g，川芎10 g，当归10 g，独活10 g，杜仲10 g，防风10 g，甘草6 g，桂枝10 g，牛膝15 g，秦艽10 g，人参10 g，桑寄生10 g。 两方均煎煮40 min，分别浓缩成50 mL 药液，灌装灭菌备用，得到补肝健膝方、独活寄生汤含生药浓度为1 g/mL的煎液。

1.3 主要试剂

乙腈、甲醇、超纯水（美国Merck 公司，批号：34851、322415、70008）；兔COMP、兔CTX-Ⅱ、兔IL-1、兔TNF-α ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：MM-826161、MM-8256101、MM-030801、MM-024001）；二甲苯、无水乙醇、95%乙醇（西陇科学股份有限公司，批号：33535、32061、2000246）；苏木素染液（北京中衫金桥有限公司，批号：ZLI-9610）；Scott蓝化液、伊红染色液（美国Solarbio 公司，批号：G1865、G1100）。

1.4 主要仪器

全自动酶标仪（北京六一有限公司，型号：WD-2012B）；药品阴凉/冷藏柜（上海博津仪器有限公司，型号：LF-Z095/800）；电热恒温培养箱（上海-恒科学仪器有限公司，型号：DHP-9082B）；高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机有限公司，型号：TGL-16.5M）；石蜡包埋机、切片机、摊片机（美国Leica 公司，型号：Leica HistoCore Arcadia、Leica HistoCore BIOCUT、Leica HI1210）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司，型号：HGZF-101-1）。

2 方法

2.1 动物模型制备

对兔右膝关节周围进行剃毛，用75%乙醇棉球擦拭消毒。 然后在髌韧带外缘进针，将0.3 mL 的4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液注入膝关节腔，屈伸膝关节使木瓜蛋白酶充分扩散于关节腔。造模开始第1、4、7 日各注射1 次，共注射3 次。造模期间对所有动物进行驱赶，2 次/d，每次30 min，连续4 周。观察兔膝关节，出现肿胀、屈伸功能障碍、局部皮温升高，下肢出现跛行，则提示KOA 模型制备成功[15-16]。

2.2 分组及给药

将新西兰大白兔自适应性喂养1 周后，随机分为空白对照组5 只，KOA 模型兔25 只。 造模成功后，采用随机数字表法将25 只模型兔分为5 组，即模型对照组、独活寄生汤组及补肝健膝方低、中、高剂量组，每组5 只。 独活寄生汤组、补肝健膝方组根据人与动物体表面积折算中药灌胃剂量，相当于临床用量的3.72 倍[17]。 补肝健膝方低、中、高剂量组给药剂量为1.962、3.924、7.848 g/（kg·d），独活寄生汤组给药剂量为2.895 g/（kg·d）[18]，空白对照组、模型对照组灌胃等体积蒸馏水，1 次/d，连续灌胃4 周。

2.3 HE 染色

取出骨组织后，使用流动清水冲洗数小时，再使用70%、80%、90%乙醇溶液脱水。 石蜡包埋，切片，烤片，之后脱蜡，水化。 将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，使用返蓝液返蓝15 s 后使用清水冲洗，伊红染色3 min，流水冲洗，脱水，透明，封片，镜下观察。

2.4 ELISA 检测

采用ELISA 检测IL-1、TNF-α、COMP 和CTX-Ⅱ的水平。取血清、关节腔积液，5 000×g 离心10 min，按照试剂盒说明书进行ELISA 检测，用酶标仪在450 nm 处测定各孔吸光度（OD）值。

2.5 统计学方法

应用SPSS 20.0 软件进行统计分析。 所有实验重复3 次，计量资料采用“±s”表示。 多组之间比较采用单因素方差分析，若数据资料不符合正态分布或方差不齐，则采用非参数检验。 检验水准α=0.05，P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 造模4 周后各组右膝关节X 线摄片结果

空白对照组兔膝关节平面光滑平整，间隙正常。造模后各组模型兔膝关节内可见骨赘生成，关节平面粗糙，关节软骨下骨可见高密度影，关节间隙明显变窄，符合KOA X 线摄片表现，提示KOA 模型兔造模成功。 详见图1。

图1 造模4 周后各组兔右膝关节X 线摄片结果

3.2 各组兔关节软骨Pelletier 评分比较

与空白对照组比较，模型对照组、独活寄生汤组及补肝健膝各剂量组Pelletier 评分升高（P<0.05）。与模型对照组比较，独活寄生汤组及补肝健膝方各剂量组Pelletier 评分均降低（P<0.05）。 与独活寄生汤组比较，补肝健膝方各剂量组Pelletier 评分均升高（P<0.05）。 详见图2。

图2 各组兔关节软骨Pelletier 评分结果比较

3.3 各组兔软骨组织HE 染色结果分析

空白对照组关节软骨表面光滑、平整，光镜下软骨细胞分层排列清楚，潮线清晰完整。模型对照组软骨关节表面不光滑、平整，浅表位置粗糙，软骨局部可见黏液样变、肿胀，出现裂隙、陷窝，软骨及深层细胞数目显著降低，与KOA 病理改变一致，提示造模成功。 独活寄生汤组软骨欠光泽，关节面稍有不平整，稍有软骨缺损和骨赘形成，但情况好于模型对照组。补肝健膝方低、中、高剂量组情况大致相同，整体情况介于空白对照组与独活寄生汤组之间，其中，补肝健膝方中、高剂量组关节表面较光滑、平整，软骨细胞及深层细胞数目增多，结构改善。 详见图3。

图3 各组兔膝关节软骨组织HE 染色（×100）

3.4 各组兔膝关节血清IL-1、TNF-α、COMP、CTX-Ⅱ比较

与空白对照组比较，模型对照组兔血清和关节腔积液IL-1、TNF-α 水平及血清COMP、CTX-Ⅱ水平均明显升高（P<0.05）。与模型对照组比较，独活寄生汤组、补肝健膝方各剂量组兔血清和关节腔积液IL-1、TNF-α 的水平及血清COMP、CTX-Ⅱ水平明显降低（P<0.05）。与独活寄生汤组比较，补肝健膝方各剂量组兔血清和关节腔积液IL-1、TNF-α 水平及血清COMP、CTX-Ⅱ水平降低（P<0.05）。详见图4—5。

图4 各组兔膝关节血清IL-1、TNF-α、COMP、CTX-Ⅱ比较

图5 各组兔膝关节积液IL-1、TNF-α 比较

4 讨论

KOA 的发病多与外伤、衰老、无菌性炎症、代谢、免疫等诸多因素关系密切，但具体的发病机制尚未明确。目前，越来越多的研究表明，KOA 患者往往伴有关节软骨细胞外基质合成与降解失衡，其中，无菌性炎性因子以及和软骨代谢有关的细胞因子在KOA 发病中发挥着重要的作用[19]。 IL-1、TNF-α 大量存在于膝关节软骨组织、上层软骨细胞与基质中，诱导并激活金属蛋白酶（metalloproteinase, MMP）的合成，并且抑制金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）的生成，加快胶原蛋白的降解，抑制软骨细胞的合成，致使软骨细胞凋亡，最终导致关节软骨的破坏[20-21]。 COMP 及CTX-Ⅱ均在炎症过程中充当诱导酶的角色，受到炎性因子刺激后，在软骨细胞、巨噬细胞及内皮细胞中高度表达[22]。COMP 为糖蛋白G 家族中的一员，是较为精准的衡量骨关节疾病的指标之一，并且是软骨受损的标志物[23]。现代研究提示，COMP 可作为KOA诊断的“金指标”[24-25]。 CTX-Ⅱ是软骨非胶原蛋白的重要组成部分，其存在不仅能更快、更有效地合成胶原，是软骨形成的成分之一，而且其代谢水平还能用于软骨生理、病理的监测[26]。 现代研究表明，KOA 患者的CTX-Ⅱ指标升高时，其软骨损失较为显著[27]。在KOA 患者中，CTX-Ⅱ、COMP 表达较高，与病情严重程度具有一定的相关性，对疾病有诊断价值[23]。王鹏等[28]发现，通过下调KOA 模型鼠软骨组织中IL-1、TNF-α 的含量，减少软骨细胞的凋亡，能有效缓解KOA 模型鼠的膝关节损伤。 刘继红等[25]研究证明，膝康注射液能有效降低KOA 患者血清COMP、IL-1、TNF-α 含量，从而改善其症状。

中医学中未明确记载KOA 的名称，根据其临床特点将其归为“膝痹”范畴。 独活寄生汤来源于《备急千金要方·偏风治腰背痛》，其主要功效为通脉络、补气血、补肝肾、祛风湿、止痹痛，是治疗膝痹的常用药方。独活寄生汤对许多可导致KOA 进展的途径都有一定的调控作用，如调控相关炎症因子、促进软骨细胞增殖分化、抑制软骨细胞凋亡等，治疗效果较好[29]。仇湘中教授根据多年临床经验认为，膝痹多因“肝虚络痹”，治以“补肝为先，筋骨并重”，认为现代医学中筋络、筋膜、关节软骨等组织均属于中医学“筋”的范畴。 《杂病源流犀烛·筋骨皮肉毛发病源流》指出“筋也者，所以束筋络骨……其主则属于肝”，阐明了筋属于肝，筋的各项功能得益于肝的濡养。 基于此，仇湘中教授总结出补肝健膝方，具有补肝养血柔筋、舒经通络止痛之功，临床试验证明其对KOA 的治疗安全有效[30]。

KOA 的发病过程与关节滑膜细胞的异常增生、活化及凋亡关系密切，因此，抑制引起免疫反应的细胞增生，并促进其凋亡，可能成为治疗KOA 的新思路[31]。 本研究结果显示，独活寄生汤组、补肝健膝方各剂量组均能有效降低KOA 兔炎性指标。与独活寄生汤组相比，补肝健膝方各剂量组HE 染色结果提示，软骨表面层次分布更为清晰，潮线结构更为完整，Pelletier 评分、血清及关节腔积液IL-1、TNF-α及血清COMP、CTX-Ⅱ表达水平降低，说明补肝健膝方可通过抑制血清、关节腔积液IL-1、TNF-α 水平以及血清中COMP 和CTX-Ⅱ的表达对KOA 兔产生作用。

本研究存在一些不足，如各组动物数量仅5只，未对远期疗效进行监测等。 因此，在之后的实验研究中，课题组将延长给药时间，进一步探究不同剂量补肝健膝方对KOA 的疗效差异，并通过检测相关通路中基因、蛋白质的变化进一步探究补肝健膝方治疗KOA 的分子机制，为未来KOA 的中医药防治提供新思路。