LC-MS法对畜禽肉中四环素类药物含量的测定与分析

张永芳，李晓

1.郑州科技学院食品科学与工程学院（郑州 450000）；2.郑州科技学院郑州市食品安全快速检测重点实验室（郑州 450000）

四环素类药物是由金黄色链霉菌所形成的一类抗菌化合物，能够抑制细菌蛋白质合成，主要包括四环素、土霉素、金霉素和强力霉素等，畜牧业中多用于治疗畜禽疾病和改善饲料利用率[1]。但四环素类药物的过度使用，不仅会使畜禽动物产生耐药性，导致疾病的突然爆发，对畜牧业的发展造成一定威胁；而且畜禽肉制品中药物残留还会通过食物链富集作用进入人体，从而产生中毒、过敏反应、三致作用（致癌、致畸、致突变作用）、病原菌耐药性及对影响胃肠道菌群等，危害人体健康[2]。我国相关法律规定，四环素类药物的最大残留限量在食品动物肌肉组织中为100～600 μg/kg[3]。四环素类药物检测技术主要免疫分析法（放射免疫分析、荧光免疫分析等）[4]、理化分析法（薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色-谱质谱法）[5-8]。其中液相色谱-质谱法（LC-MS）将液相色谱和质谱优点结合起来，其分离能力强、高选择性、高灵敏度，被广泛地应用在食品分析领域中[9]。此次研究依据GB/T 21317—2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方式 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》，对畜禽类样品的前处理、质谱和色谱条件进行优化，以建立一个更便捷、高效的LC-MS快速检测方法，为四环素类药物的检测提供快速、有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料选自郑州市银合农贸市场随机选择的猪肉、鸡肉和鸭肉。

无水硫酸钠：分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠（分析纯，天津致远化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津致远化学试剂有限公司；柠檬酸（分析纯，天津致远化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；乙酸（色谱纯，天津致远化学试剂有限公司）；乙腈：色谱纯，福晨（天津）化学试剂有限公司，天津致远化学试剂有限公司；甲醛（色谱纯，天津致远化学试剂有限公司）；甲酸（色谱纯，天津致远化学试剂有限公司）；标准物质：土霉素、四环素、金霉素、强力霉素，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH（纯度均大于95%）；纯净水（一级，杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.2 仪器与设备

赛默飞TSQ Quantis Plus三重四极杆质谱仪（美国）；电子分析天平（TXB622L，日本岛津）；电子分析天平（AUX120，日本岛津）；氮吹仪（HSC-24B，天津恒奥科技有限公司）；旋涡混匀器（IKA/艾卡MS3，德国）；多管旋涡混合仪（E0AAHM-01，上海安谱实验科技股份有限公司）；超声波清洗机（SB25-12DTD，宁波新芝）；高速冷冻离心机（3K15，北京五洲东方科技发展有限公司）；50 mL尖底离心管（北京兰杰科技有限公司）；15 mL尖底离心管（北京兰杰科技有限公司）；HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，江苏杰岛高新材料科技有限公司）；搅碎机；试验所用一次性吸管、一次性使用无菌注射器及0.22 μm有机滤膜，皆由河南省安必诺检测技术有限公司实验室提供。

1.3 溶液配制

1.3.1 四环素标准储备液的配制

依据纯度折算为100%质量的四环素、土霉素、强力霉素、金霉素各称取10.0 mg，分别通过用甲醇溶解将其定容至100 mL容量瓶内，所获得的质量浓度为100 mg/L，在-18 ℃以下保存，储备液放入棕色瓶中，可储存1年以上。

1.3.2 混合标准工作溶液的配制

根据需要，将0.1%甲酸+5%甲醇水溶液稀释至所用浓度，制备混合标准工作溶液以便立即使用。

1.3.3 其他溶液的配制

1.3.31 0.1 mol/L柠檬酸溶液

准确称取21.01 g柠檬酸，用水定容至1 000 mL，摇匀，使其溶解。

1.3.32 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液

准确称取28.41 g磷酸氢二钠，用水定容至1 000 mL，摇匀，使其溶解。

1.3.33 Mcllvaine缓冲溶液

将1 000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液混合。

1.3.34 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvine缓冲溶液

称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠放入1 625 mL Mcllvaine缓冲溶液中，并旋涡1 min，使其完全溶解。

1.3.35 甲醇+水

准确量取5 mL甲醇和95 mL水将其混合。

1.3.36 甲醇+乙酸乙酯

量取10 mL甲醇与90 mL乙酸乙酯混合。

1.3.37 OasisHLB固相萃取柱

规格为60 mg/30 mL，使用前用5 mL甲醇和5 mL水进行预处理，保持柱体湿润。

1.3.38 0.1%甲酸

量取1 mL甲酸，用水定容至1 000 mL。

1.3.39 5%甲醇

量取5 mL甲醇，用水定容至100 mL。

1.3.3.10 0.1%甲酸-5%甲醇

1 000 mL 0.1%甲酸与100 mL 5%甲醇混合。

1.3.3.11 1%乙酸乙腈溶液

准确量取10 mL乙酸与990 mL乙腈，将其混匀。

1.4 试验方法

1.4.1 样品制备及贮存

为防止（猪肉、鸡肉、鸭肉）在空气中受到污染或残留物量发生改变，在所有样品中分别取800 g，通过机器高速搅拌均匀搅碎，均分成2份，1份为备样，1份用做分析，装入干净自封袋中，密封过后贴标签做标记，2份别用于留样和分析，将标记的样品在-18℃以下的温度下冷冻储存。

1.4.2 测定步骤

1.4.21 国标方法的样品前处理[10]

称取2.0 g（精确到0.01 g）待测样品，分别放入50 mL尖底离心管中，依次加入20，20和10 mL的0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvainc缓冲液，并在冰水中进行超声波处理，进行3次提取，每次旋涡1 min，超声波处理10 min，离心速度3 000 r/min，离心5 min（温度控制在15 ℃），合并上清液，定容至50.0 mL，涡旋5 000 r/min，冷冻离心10 min（温度控制为15 ℃），并用滤纸过滤，耐心等待净化。

用移液枪精准吸取10 mL提取液，以1滴/s的速度过HLB固相萃取柱，使用前用5 mL甲醇和5 mL水进行活化。等待液体全部流完，依次用5 mL水和5 mL甲醇-水淋洗HLB固相萃取柱，全部倒掉流出液，抽干5 min，用10 mL甲醇+乙酸乙酯进行洗脱，将洗脱液用氮气吹至近干（温度控制40 ℃以下），加入1 mL 0.1%甲酸5%甲醇水溶解杂质，过0.22 μm滤膜，用LC-MS法测定。

1.4.22 优化后的样品前处理

准确称取2.0 g（精确到0.01 g）样品已被搅碎后的试样放入50 mL尖底离心管中，在离心管中添加4 g无水硫酸钠和4 g乙二胺四乙酸二钠，加入10 mL 1%乙酸乙腈，对其进行涡旋提取5min，利用超声波10 min，按6 000 r/min离心5 min。用一次性5 mL吸管，吸取5 mL上清液放入15 mL离心管中，收集溶液在40 ℃内水浴，直到氮气吹至近干，加1 mL 0.1%甲酸5%甲醇水溶液溶解杂质，上振荡器涡旋1 min，超声波3 min，按9 000 r/min离心3 min，离心完后，弃去上层油脂，立即用注射器吸出，并通过0.22 μm有机滤膜上机，供LC-MS法测定。

1.4.3 色谱条件与质谱条件

1.4.31 色谱条件

色谱柱Accucore C18（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量10 μL；流动相A2为0.1%甲酸水，B1相为甲醇。

表1 梯度洗脱条件

1.4.32 质谱条件

离子源，采用电喷雾离子；扫描方式，采用正离子扫描；检测方式，采用多重反应监测（SRM）；喷雾电压3 500 V；鞘气压力35 Arb；辅助气压力5 Arb；尾吹气压力0 Arb；离子传输管温度350 ℃；雾化温度350 ℃。

表2 化合物检测离子对

1.5 方法验证

1.5.1 线性范围

选取空白样品，加入标准系列标准溶液，按照优化后的前处理步骤进行操作，上机检测，纵坐标（y）表示峰值面积，横坐标（x）表示溶液浓度，绘制标准曲线，得到线性回归方程和相关系数R2值，判断线性关系是否良好。

1.5.2 标准曲线和加标回收率试验

1.5.21 标准曲线

配制系列的标准溶液，用0.1%甲酸5%甲醇水溶液配制5，10，25，50和100 μg/mL的系列工作液，分别从低浓度到高浓度进样，纵坐标表示峰面积，横坐标表示溶液浓度，制作标准曲线。

1.5.22 加标回收率试验

准确称取2.0 g（精确到0.01 g）样品，将样品（猪肉、鸡肉、鸭肉）分别做3次平行样品，将样品在不同浓度下制备3个50 mL尖底离心管，分别为20，50和100 μg/kg质量分数添加4种药物混合标液。运用式（1）计算[11]，并进行3次平行试验，计算平均回收率。

1.5.3 检测限和定量限的确定

检出限的定义为添加较低含量目标物进行添加回收试验时可产生3倍信噪比（rSN≥3）的化合物的质量浓度，而定量限是指通过添加法经测定方法的全过程测定可以可靠地确定样品中化学污染物的最低浓度，一般也认为是至少产生10倍信噪比（rSN≥10）的化合物的质量浓度[12]。

2 结果与分析

2.1 仪器方法优化结果

四环素类药物（四环素、土霉素、金霉素、强力霉素）混合标准溶液、猪肉空白样品、鸡肉空白样、鸭肉空白样品添加药物。样品加标浓度为100 μg/mL，将国标方法与该方法平均回收率进行比较见表3，该方法采用1%乙酸乙腈提取溶剂，回收率优于国标法，该方法准确度高、操作过程简便快捷、成本低。

表3 国标法和试验方法平均回收率

由表3的检测结果可知，优化后的试验方案中采用1%乙酸乙腈，提取效果好，样品中四环素类药物（四环素、土霉素、金霉素、强力霉素）的加标回收率均比优化前要高。国标法试验方法的猪肉加标的平均回收率为48.3%～109.6%，鸡肉加标的平均回收率49.7%～115.6%，鸭肉加标的平均回收率50.9%～60.6%；SRSD为2%～11%。优化后的试验方法测得猪肉加标的平均回收率82.8%～119.5%，鸡肉加标的平均回收率83.2%～120.4%，鸭肉加标的平均回收率86.9%～94.6%，SRSD为0.7%～3.6%。

试验比较1%乙酸乙腈和0.1 mol/L Na2EDTAMcllvainc缓冲液提取效果，但0.1 mol/L Na2EDTAMcllvaine缓冲溶液提取液，浑浊且黏稠，杂质多，滤纸过滤时间长，容易堵塞HLB柱。针对HLB柱堵塞问题，在缓冲溶液中加入乙腈，有利于促进沉淀蛋白，提取液变清透，当乙腈含量增加，沉淀蛋白效果更佳，但使用HLB柱净化时，为降低乙腈含量需要稀释提取液，过程繁琐。试验中优化乙酸含量，发现加入1%乙酸时，提取效果更优，可获得很高的待测物的加标回收率。因此，采用1%乙酸乙腈进行提取。另外，动物源性食品中脂肪含量较高，对回收率和检测结果造成一定程度影响，提取溶液用乙腈时，大量干扰物质会被抽离出来，大部分干扰物是油脂，为将样品中的油脂类的干扰物抽离出去，采用高速冷冻离心去除油脂，该方法在低温情况下会将油脂类的干扰物从溶液中分离出来，以达到最佳的净化分离效果。复溶后，高速冷冻离心能很好地去除样品中的油脂类干扰物。

2.2 四环素类药物（四环素、土霉素、金霉素、强力霉素）标准曲线线性关系

配制一系列的标准溶液，按照低浓度到高浓度依次进样，质量浓度为5，10，25，50和100 μg/mL的系列工作液，以峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.1 四环素标准工作曲线

四环素在不同浓度不同样品经过检测后，求得的回归方程及相关系数见表4，由有相关系数（R2＞0.999）可知，四环素在5～100 μg/mL质量浓度范围内线性关系较好，适合用于样品的检测。

表4 检测猪肉、鸡肉、鸭肉中四环素工作曲线的回归方程及相关系数

2.2.2 土霉素标准工作曲线

土霉素在不同浓度不同样品经过检测后，求得的回归方程及相关系数见表5，由相关系数（R2＞0.999）可知，土霉素在质量浓度范围5～100 μg/mL时，线性关系较好，适合用于样品的检测。

表5 检测猪肉、鸡肉、鸭肉中土霉素工作曲线的回归方程及相关系数

2.2.3 金霉素的标准工作曲线

金霉素不同浓度不同样品经过检测后，求得的回归方程及相关系数，见表6。由相关系数（R2＞0.999）可知，金霉素在质量浓度范围5～100 μg/mL时，线性关系比较好，适合用于样品的检测。

表6 检测猪肉、鸡肉、鸭肉中金霉素工作曲线的回归方程及相关系数

2.2.4 测定强力霉素的标准工作曲线

配制的强力霉素不同浓度不同样品进过检测后，求得的回归方程及相关系数见表7。由相关系数（R2＞0.999）可知，强力霉素在5～100 μg/mL质量浓度范围内线性关系较好，适合用于样品的检测。

表7 检测猪肉、鸡肉、鸭肉中强力霉素工作曲线的回归方程及相关系数

四环素类药物在质量浓度范围5～100 μg/mL之间，不同浓度与响应值（峰值面积）呈现良好线性关系，R2值在0.999～1之间，均大于0.999。

2.3 回收率和相对标准偏差

2.3.1 猪肉样品

检测时用猪肉样品在20，50和100 μg/mL这3个水平质量浓度上分别进行添加回收率试验，并且进行3次平行试验。四环素类药物（四环素、土霉素、金霉素、强力霉素）在不同样品中准确度结果见表8。

表8 测定猪肉中四环素类药物（四环素、土霉素、金霉素、强力霉素）回收率

由表8可知，测定猪肉中四环素类药物（土霉素、金霉素、四环素、强力霉素）的回收率在20，50和100 μg/kg这3个质量分数水平：猪肉中加标质量分数20 μg/kg时，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素平均回收率分别为85.5%，86%，137.2%和126.1%。加标质量分数50 μg/kg时，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素平均回收率分别为108.9%，115%，113.2%和107.8%。加标质量分数100 μg/kg时，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素平均回收率分别为86%，82.8%，119.5%和85.8%。

2.3.2 鸡肉样品

检测时用鸡肉样品在20，50和100 μg/kg这3个水平质量分数上分别进行添加回收率试验，并且进行3次平行试验。四环素类药物（土霉素、金霉素、四环素、强力霉素）在不同样品中准确度结果见表9。

由表9可知，测定鸡肉中四环素类药物（土霉素、金霉素、四环素、强力霉素）的回收率在20，50和100 μg/kg这3个质量分数水平：鸡肉中加标质量分数20 μg/kg时，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素平均回收率分别为128.6%，96.6%，211.6%和158.3%；加标质量分数50 μg/kg时，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素平均回收率分别为149.6%，106.9%，136.1%和109.2%；加标质量分数100 μg/kg时，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素平均回收率分别为83.2%，90.6%，120.4%和95.9%。

表9 测定鸡肉中四环素类药物（四环素、土霉素、金霉素、强力霉素）回收率

2.3.3 鸭肉样品

检测时用鸭肉样品在20，50和100 μg/kg这3个水平质量分数上分别进行添加回收率试验，并且进行3次平行试验。四环素类药物（土霉素、金霉素、四环素、强力霉素）在不同样品中准确度结果见表10。

表10 测定鸭肉中四环素类药物（四环素、土霉素、金霉素、强力霉素）的回收率

由表10可知，测定鸭肉中四环素类药物（土霉素、金霉素、四环素、强力霉素）的回收率在20，50和100 μg/kg这3个质量分数水平：鸭肉中加标质量分数20 μg/kg时，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素平均回收率分别为183.4%，164.1%，163.3%和118.5%；加标质量分数50 μg/kg时，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素平均回收率分别为144.7%，169.8%，190.5%和129.6%；加标质量分数100 μg/kg时，四环素、土霉素、强力霉素、金霉素平均回收率分别为86.9%，87.5%，94.6%和88.6%。

综上，试验方法检测猪肉、鸡肉、鸭肉中四环素类药物残留，准确称取2.0 g（精确到0.01 g）样品，样品中添加混合标准工作液，加标质量分数分别为20，50和100 μg/kg，按照优化后的前处理进行操作，四环素平均回收率为83.2%～183.4%，土霉素平均回收率为82.8%～169.8%，强力霉素为94.6%～211.6%，金霉素为85.8%～158.3%，SRSD在0.7%～9.0%之间，SRSD均小于10%，均符合兽药残留分析的要求。

2.4 检测限和定量限的确定

加标水平5 μg/kg情况下，测得四环素、土霉素、金霉素、强力霉素的rSN≥3，加标水平25 μg/kg情况下，测得四环素、土霉素、金霉素、强力霉素的rSN≥10。因此，样品中的检出限为5 μg/kg，定量限为25 μg/kg。

3 结语

试验采用LC-MS法对四环素类药物进行检测与研究，通过对样品前处理的优化，使用1%乙酸乙腈溶液提取，提取效果好，样品的回收率高。LC-MS法测定四环素类药物素残留，对猪肉、鸡肉、鸭肉进行回收率试验，测得四环素平均回收率83.2%～183.4%，土霉素平均回收率82.8%～169.8%，强力霉素平均回收率94.6%～211.6%，金霉素平均回收率85.8%～158.3%。通过对4种四环素类药物质量浓度5～100 μg/mL内范围进行考察，不同浓度与响应值（峰值面积）都有良好的线性关系，R2≥0.999，准确度较高。优化后的方法检出限为5 μg/kg，而定量限为25 μg/kg，优化后的方法灵敏度较好，因此更符合四环素兽药残留的定量分析。过试验数据与研究，试验方法简便快捷、提取回收率高、准确度和灵敏度高，适合广泛应用于动物源性食品中检测四环素类药物，HLB固相萃取柱市场价1支最低在6元左右，优化后的前处理降低了成本。