快速现场评估的细胞学涂片对非小细胞肺癌分子检测的补充作用

唐诗琪 唐纯丽 林泽云 姜桔红

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常见的肺癌组织学类型，约占肺癌病例的80%[2]。约70%的肺癌患者因诊断时病情已处于晚期或伴有转移而不能手术，只能通过小活检组织或细胞学标本进行诊断[3]。随着NSCLC驱动基因研究的进展，对于新诊断的晚期NSCLC，需要检测的治疗相关标志物将会进一步增加[1-3]，临床对小活检标本和细胞学标本辅助分子检测的需求将持续增长。目前普遍认为福尔马林固定的石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedding,FFPE）组织切片是较为可靠的肿瘤分子检测材料。然而，部分石蜡包埋组织较少，有时进行组织学诊断或补充性的免疫组化检测之后没有足够的肿瘤细胞进行分子检测，重复活检又将增加患者的负担。现有的研究[4]报道肺癌小活检标本进行第二代测序（next-generation sequencing,NGS）的标本合格率只有60%-80%。虽然液态活检对分子检测有一些补充作用，但是存在30%左右的假阴性[5,6]。寻找可靠的组织来源以完成多种检测方法仍然是临床病理的一大挑战。

快速现场评估（rapid on-site evaluation,ROSE）是指在介入活检操作过程中，对现场获得的小活检或细胞学标本立即进行细胞学制片、染色、评估，以初步判断取材是否成功及指导下一步操作和标本处理[7,8]。术中ROSE可提高穿刺成功率，减少穿刺次数，降低并发症。有研究与指南[9-12]推荐，NSCLC分子检测标本可以采用细胞蜡块也可以是其他细胞学标本（直接涂片或液基细胞学涂片）。本研究回顾性分析了我院经支气管镜肺活检术（transbronchial forceps lung biopsy,TBLB）或者超声内镜引导下的经支气管针吸活检（endobronchial ultrasound transbronchial needle aspiration,EBUS-TBNA）并进行了术中ROSE的NSCLC病例。采用显微镜观察评估所有病例石蜡切片及其配对的ROSE细胞学涂片肿瘤细胞量及比例，以探讨ROSE细胞学涂片标本对NSCLC分子检测的补充作用。

1 资料与方法

1.1 临床病例收集 纳入2020年8月至2022年12月于广州医科大学附属第一医院呼吸介入科行TBLB及EBUS-TBNA活检且术中行ROSE病例。纳入病例的小活检标本均由本院呼吸病理中心完成常规病理学检查并最终诊断为NSCLC。经我院的临床信息系统及病理信息系统查询并收集每例患者的年龄、性别、标本来源及其取材方法以及免疫组织化学结果等信息，调取每例患者的石蜡切片和ROSE细胞涂片进行质量评估。本研究经广州医科大学第一附属医院机构审查委员会批准（审批编号：2021-70；批准日期：2021年8月16日）。

1.2 ROSE细胞涂片制作方法 TBLB获取标本后，用镊子夹住小活检组织在载玻片上的1-2 cm的椭圆形区域顺时针方向滚涂（组织印片）。EBUS-TBNA获取标本后，用针芯推出组织，并用抽满空气的注射器再次吹出套管针内残留的液体，滴一滴于载玻片上，用另一块玻片垂直方向推动液体（涂片）。每例患者至少制作两张涂片，涂片后立即采用迪夫染液对空气晾干的细胞学涂片进行快速染色，染液系按照世界卫生组织（World Health Organization,WHO）推荐的快速染色方法配制[13]。如果前面两次活检操作为阳性，后面两次操作获取的组织全部留作石蜡切片。

1.3 石蜡切片和ROSE细胞涂片的肿瘤细胞量评估 纳入的病例均有配对的石蜡组织切片和ROSE细胞学涂片。所有病例石蜡组织进行诊断性免疫组化连续切片，对最后一张石蜡切片的肿瘤细胞数量和比例进行评估。在光学显微镜下观察整张切片的每一块小组织，或将切片分为若干个区域，依次计数每小块组织或区域的肿瘤细胞及正常细胞数量，计算肿瘤细胞总的数量及比例。ROSE细胞学涂片的评估采用光学显微镜从左至右依次观察涂片所有区域，计算肿瘤细胞总的数量及比例。

1.4 ROSE细胞涂片DNA提取 由本研究的实验人员采用QIAGEN DNA提取试剂盒（DNeasy Blood and Tissue Kit）提取ROSE细胞涂片标本DNA，具体步骤如下：两张ROSE涂片分别滴90 μL Buffer ATL，覆盖玻片上有细胞的区域，用一次性手术刀片刮下细胞，聚拢液体成分，用移液器吸取液体置于1.5 mL离心管中，加入20 μL蛋白激酶K，振荡混匀，56oC孵育至组织完全裂解后按照试剂盒说明书的操作流程进行，最后采用100 μL Buffer AE洗脱获得DNA，采用超微量分光光度计测量DNA浓度后储存于-20oC冰箱中。

1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术及高通量NGS检测分子突变 本院临床诊疗过程中检测NSCLC患者靶基因突变最常用的两种平台有厦门艾德生物医药科技股份有限公司的肺癌9个基因突变实时定量PCR联合检测试剂盒和北京吉因加检验所的包含1021个基因的高通量NGS套餐[14,15]。两种检测方法均包含美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南推荐检测的9个基因的突变：表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、BRAF、ERBB2、KRAS基因突变，间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）、ROS1、RET、NTRK1/2/3基因融合、MET基因扩增和MET基因14号外显子跳跃突变。实时定量PCR要求的最低DNA量是10 ng，NGS要求的最低DNA量是50 ng。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS 25.0软件进行分析和处理。采用斯皮尔曼相关性分析ROSE涂片肿瘤细胞量与DNA提取总量的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征 本研究纳入308例患者，中位年龄64岁（30-85岁），其中男性210例，女性98例；TBLB取材标本210例，EBUS-TBNA取材标本98例。病例均经石蜡切片及免疫组织化学诊断为NSCLC：其中腺癌196例，鳞状细胞癌88例，非特殊类型癌24例。

2.2 石蜡组织和ROSE细胞涂片的肿瘤细胞数量及比例 根据每张石蜡切片的肿瘤细胞数量和比例，将石蜡组织标本分为两组：不合格组：每张切片＜200个肿瘤细胞或肿瘤细胞比例＜10%；合格组：每张切片≥200个肿瘤细胞且肿瘤细胞比例≥10%。根据每例患者所有ROSE细胞涂片的肿瘤细胞总量和比例对ROSE细胞涂片标本进行分组。低量：患者所有ROSE涂片细胞总量＜1000个肿瘤细胞或肿瘤细胞比例＜10%，不满足分子检测条件；中量：患者所有ROSE涂片细胞总量为1000-3000个肿瘤细胞且肿瘤细胞比例≥10%，满足分子检测条件；高量：每例患者所有ROSE涂片细胞总量＞3000个肿瘤细胞且肿瘤细胞比例≥10%，非常适合于分子检测。在308例ROSE涂片标本中，低量组98例，中量组146例，高量组64例；分析发现TBLB组和EBUS-TBNA组ROSE细胞涂片分子检测合格率分别为76.2%和51.0%（表1）。

表1 TBLB和EBUS-TBNA标本的配对的FFPE切片和ROSE肿瘤细胞量的分组详细情况Tab 1 Cellularity and adequacy rate of paired FFPE section and ROSE smears in TBLB and EBUS-TBNA

2.3 ROSE细胞涂片样本对石蜡切片分子检测合格率的补充作用 在210例TBLB标本中，两种标本结合使用的情况下，合格率由71.0%提高至90.5%。在98例EBUS-TBNA标本中，两种标本结合使用的情况下，合格率由82.7%提高至85.7%（表2）。图1展示了石蜡包埋切片与ROSE的细胞学特征。

图1 FFPE切片的组织学特征与ROSE的细胞学特征。A、B：仅少量供诊断的肿瘤细胞存在于HE染色的石蜡包埋切片；C、D：较多肿瘤细胞存在于迪夫染色的ROSE组织印片。Fig 1 Histology characterization of FFPE tissue section and cytomorphology of ROSE.A,B shows the HE-stained FFPE tissue section for only the diagnostic tiny tumor tissue;C,D is the Diff-Quik-stained ROSE touch preparations of the same case showing abundant tumor cell clusters or clumps on the slide.A and C: Original magnification ×100;B and D: Original magnification ×400.HE: hematoxylin-eosin.

表2 ROSE细胞涂片样本对FFPE切片分子检测合格率的补充作用Tab 2 Supplemental effect of ROSE smear samples on the adequacy rate of molecular detection in FFPE sections

2.4 ROSE细胞涂片标本的DNA 提取量 TBLB组210例ROSE细胞涂片提取的DNA量中位数为17.4ng（0-423.7ng），DNA量＞10 ng（实时定量PCR检测要求的最低DNA 量）的病例占74.3%（156/210），＞50 ng（NGS检测要求的最低DNA量）的病例占16.7%（35/210）。EBUS-TBNA 组98例ROSE细胞涂片提取的DNA量中位数为12.65 ng（0-158.4 ng），DNA量＞10 ng的病例占61.2%（60/98），＞50 ng的病例占9.2%（9/98）。采用斯皮尔曼相关性分析ROSE涂片肿瘤细胞量与DNA提取总量的关系，结果表明，ROSE涂片肿瘤细胞量与DNA提取总量具有显著相关性（相关系数rho值=0.792，P＜0.001），具有统计学意义，ROSE细胞涂片肿瘤细胞量高，提取的DNA总量高（表3）。

表3 ROSE细胞涂片肿瘤细胞量与DNA总量的相关性Tab 3 The correlation between cellularity and DNA yield of ROSE smears from TBLB and EBUS-TBNA

2.5 分子检测结果 在标本收集过程中，有92例患者的石蜡组织标本遵照医嘱进行了肺癌9个基因突变实时定量PCR联合检测，有38例患者的石蜡组织标本遵照医嘱进行了NGS检测，我们从这些病例配对ROSE细胞涂片标本中为两种检测方法各挑选了5例肿瘤细胞量合格的ROSE细胞涂片标本进行了相同的检测。在这10例配对标本中，石蜡组织中检测到的所有驱动突变均在其配对的ROSE细胞涂片标本中检测到。44例石蜡组织不合格但其配对的ROSE细胞涂片合格标本中，8例提取的DNA量＜10 ng，25例DNA量为10-50 ng，11例提取的DNA量＞50 ng，DNA量＞50 ng的11例标本进行了NGS检测，11例标本均检测到体细胞突变，其中9例检测到驱动基因突变（表4）。DNA量为10-50 ng的25例标本进行了肺癌9个基因突变实时定量PCR联合检测，其中15例检测到驱动基因突变（表5）。

表4 FFPE切片组织不合格但其配对ROSE细胞涂片合格标本NGS突变详细情况Tab 4 Mutation details of NGS of samples that were inadequate for FFPE sections but were adequate for paired ROSE cell smears

表5 FFPE切片组织不合格但其配对ROSE细胞涂片合格标本PCR检测突变详细情况Tab 5 Mutation details of PCR of samples that were inadequate for FFPE sections but were adequate for paired ROSE smears

3 讨论

相关驱动基因突变的分子检测已成为多种癌症的标准治疗方案。随着靶向治疗药物种类的增加，临床对小样本（包括细胞学标本和小活检）辅助分子检测的需求将持续增长。对于肺癌尤其如此，因为许多肺癌患者就诊时已经是疾病晚期，无法进行手术治疗。我们经常面临在相对较少的样本上进行分子检测的挑战。目前，所有肿瘤标本的病理诊断方法，包括形态分型、免疫组织化学和分子分型几乎全是依赖于FFPE组织切片。其他形式的标本，例如直接涂片、液基细胞学涂片及ROSE细胞学涂片被利用的程度不高。如何通过微创手术获得足量标本以进行组织学诊断和分子分型，从而精准指导后续治疗，是临床医师和病理科工作人员面临的关键问题。

组织印片或针吸细胞学涂片结合迪夫快速染色法的ROSE技术已逐步发展成为介入学科的重要辅助手段，特别是在呼吸系统疾病的诊断中。ROSE可以对标本进行现场解读，迅速给出初步诊断，并对下一步操作给予指导。ROSE优化了常规支气管镜、EBUS-TBNA和经皮肺穿刺等活检手段的诊断效能和准确性。在本研究中，我们发现大部分NSCLC患者TBLB及EBUS-TBNA的ROSE细胞学涂片有丰富的肿瘤细胞，利用合格的ROSE涂片进行分子检测的准确性等同于或优于石蜡组织标本。它可以作为石蜡组织标本的重要的补充标本，也可以与患者的石蜡组织标本或其他细胞学标本结合使用。

Harada等[7]研究表明，单独采用细胞蜡块时，针吸标本的分子检测合格率仅为36%，增加迪夫快速染色的细胞学涂片标本后，分子检测合格率提高到68%。Fielding等[8]研究表明EBUS-TBNA标本的迪夫快速染色的细胞学涂片提取的DNA量及分子检测合格率比对应的组织蜡块高，细胞涂片与石蜡切片标本检出的突变数量相当。33例配对标本中，共有10例检出驱动基因突变，其中8例在细胞涂片和石蜡切片标本中均有检出，1例仅在细胞涂片标本中检出，1例仅在石蜡切片标本中检出；有24例共检出41个非驱动基因突变，其中20例的29个非驱动基因突变在细胞涂片和石蜡切片均检测出，3例的8个非驱动基因突变仅在细胞涂片中检出，4例的4个非驱动基因突变仅在石蜡切片中检出。有研究[8]认为肿瘤细胞数量＞1000且肿瘤细胞比例≥25%的细胞涂片标本预示可以获取高量的DNA并成功进行NGS，本研究也证实了这个观点。

本研究发现，与石蜡切片相比，采用ROSE细胞涂片进行分子检测有三方面的优势：（1）从细胞涂片提取DNA在操作步骤上可省去石蜡包埋、切片、刮片、脱蜡等过程，可减少分子检测流程的时间。（2）ROSE细胞涂片具有“所见即所得”的优点，载玻片上观察到的肿瘤细胞都可用来提取DNA，评估的肿瘤细胞量能更好地预示后续分子检测的成功。而石蜡组织只能通过观察表面的一张切片进行肿瘤细胞量的评估，这并不能真实反映深层组织连续多次切片后的肿瘤细胞量。（3）组织在福尔马林固定过程中，核酸与福尔马林形成加和物，影响DNA质量，导致获得的DNA量明显减少，并且为片段化的DNA。而细胞涂片标本未经福尔马林固定，能获得更高质量的DNA[16,17]。另外，石蜡组织的4-5 μm切片只能代表细胞的一个切面，不能代表完整的细胞，而细胞涂片为完整的细胞。所以从细胞涂片提取的DNA质量优于石蜡切片提取的DNA，分子检测要求的最低DNA量减少5-8倍时仍可获得满意结果[18]。目前各种分子检测平台包括实时定量PCR法及NGS法，标本合格的要求不仅包括最低肿瘤细胞量还包括最低肿瘤细胞比例。肿瘤细胞量或肿瘤细胞比例过低都可导致假阴性结果[11,19-22]。因此，在分子检测标本的选择过程中，从肿瘤细胞比例方面考虑，一些病例的ROSE细胞涂片标本会优于其对应的石蜡切片标本。应用ROSE细胞涂片作为替代的样本进行分子检测后，相应的石蜡切片标本可用做更合适的检测，例如免疫组化检测ALK、ROS1和细胞程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）的表达，荧光原位杂交（fluorescencein situhybridization,FISH）检测基因融合、重排或基因扩增。

Tong等[23]研究了肺芯针穿刺标本的ROSE细胞涂片和配对石蜡切片肿瘤细胞量，发现ROSE的组织印片技术可影响后续石蜡组织的肿瘤细胞量，导致部分病例的ROSE细胞涂片上黏附有较多的肿瘤细胞，而石蜡组织切片仅有少量或无肿瘤细胞残留。进一步的体外实验[24]证实，印片操作过程中太过用力或组织拖行过长，可导致石蜡组织提取的DNA量减少25%以上。因此ROSE印片操作过程中要避免用力过大，以免耗竭组织中的肿瘤细胞。本研究发现，采用组织印片的TBLB标本有相当一部分病例存在石蜡切片肿瘤细胞量少而ROSE细胞涂片肿瘤细胞量多的情况。而采用涂片的EBUS-TBNA标本这种情况较少。因此选择分子检测标本时要注意综合考虑石蜡组织和细胞涂片这两种标本，单选用石蜡组织而不采用ROSE细胞涂片可能导致部分患者无足够的标本进行分子检测，特别是采用组织印片技术的TBLB活检标本。

本研究的不足之处在于，我院呼吸介入科只在部分TBLB及EBUS-TBNA小活检术中行ROSE检测，本研究为回顾性研究，收集的为非连续性病例，有可能存在抽样偏差。未来有必要开展前瞻性的连续病例研究，全面地评估ROSE操作对小活检标本石蜡切片的影响及ROSE细胞涂片对分子检测的补充作用。另外，本研究仅对10例配对的石蜡切片和ROSE细胞涂片标本进行分子检测，初步说明ROSE细胞涂片与石蜡切片分子检测的结果相同。有必要增加配对样本的分子检测，进一步明确这两种样本分子检测的敏感性、特异性。

本研究表明，部分行术中ROSE的病例存在石蜡切片标本肿瘤细胞量较少，而其细胞涂片标本肿瘤细胞较丰富。合格的ROSE细胞涂片进行分子检测的准确性等同于或优于石蜡组织标本。采用ROSE细胞涂片补充石蜡切片标本进行分子检测增加了小活检标本分子检测的标本合格率，增加了靶向药物的分子标志物的发现，为更多的患者选择靶向治疗提供了机会。建议选择分子检测标本时综合考虑石蜡组织和细胞涂片这两种标本。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Jiang JH conceived and designed the study.Tang SQ and Lin ZY performed the experiments.Tang SQ analyzed the data.Tang CL provided study material or patients.Jiang JH and Tang CL provided critical inputs on design,analysis,and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.