强骨通痹胶囊对大鼠骨关节炎炎症因子的影响及作用机制*

李 浩, 何承建, 张天臣

湖北中医药大学第一临床学院,武汉 430074

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是由于局部退化和环境改变等因素引起的一种骨关节退行性病变[1]。目前西药治疗OA具有起效快和延缓关节软骨破坏等优势,但具有较多的不良反应[2]。手术治疗的方法虽然能够矫正关节畸形并恢复关节功能,但因为其较高的医疗费用和感染等风险并没有得到广泛的普及[3]。而目前中医药治疗OA则有经济简便、不良反应少和疗效显著等优势[4]。已有研究显示,多种健骨方可以显著缓解OA的症状并缓解软骨损伤[5]。其中组方为骨碎补、牛膝、独活、续断、川芎和白芍的强骨通痹胶囊则是治疗方法之一。但目前强骨通痹胶囊的组方对骨关节炎的治疗机理尚不清楚。

OA和其他炎症相似,受到Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)调控[6],而其受累的关节中也存在多种炎性因子的过度表达,这些炎症因子在OA发生及发展的过程中发挥着至关重要的作用[7]。其中,白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)和白介素6(interleukin-6,IL-6)是关键的炎性因子[7]。

许多中药都被发现具有影响促炎症因子表达的作用[8-10],本文猜测,强骨通痹胶囊能够通过调节促炎症因子进而对OA起到治疗作用。基于此,本研究构建大鼠骨关节炎模型,使用强骨通痹胶囊进行治疗,探讨强骨通痹胶囊对大鼠骨关节炎炎症因子的影响和作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康的雄性4～6周龄SPF级SD大鼠42只,实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2018-0104,于温度22～26 ℃,相对湿度50%～60%的饲养条件下进行饲养,人工光照明暗各12 h。在本次实验过程中,按照《实验动物管理条例》等相关文件标准进行饲养与处置。

1.2 试剂

戊巴比妥钠(货号P3761,Sigma公司);葡萄糖胺(货号G1514,Sigma公司);生理盐水(货号YM-S2134,上海远慕生物科技公司);Trizol(货号15596026,Ambion公司);中性树脂(货号为213,上海国药公司);甲苯胺蓝染色液(货号G1032,Servicebio公司);DAB浓缩型试剂盒,封闭山羊血清(货号分别为DA1010,SL038,Solarbio公司);苏木精,20× Tris-EDTA修复液pH 9.0(货号分别为G1004,G1203,Servicebio公司);IL-1β酶联免疫试剂盒,TNF-α酶联免疫试剂盒,IL-6酶联免疫试剂盒,TLR4蛋白一抗(货号分别为RA20020,RA20035,RA20607,PAB33926,Bioswamp公司);大鼠磷酸化核因子(p-NF-κB)蛋白一抗(货号为Ab32360,Abcam公司);MaxVisionTMHRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit(货号KIT-5020,迈新公司)。

1.3 仪器

荧光定量PCR仪(型号CFX-Connect 96,Bio-Rad公司);正置显微镜(型号V116295,尼康公司);正置显微镜(型号JZYQ,皆准公司);石蜡切片机(型号API-365,艾普公司);摊片烤片机,生物组织包埋机-冷冻机(型号分别为TK7218,HS-B,恒松公司);生物组织包埋机(型号KH-BL1,孝感阔海公司);自动组织脱水机(型号ZT-12 P2,亚光病理公司);全自动化学发光分析仪(型号FST-I-05,普力菲尔公司)

1.4 大鼠骨性关节炎模型的构建

根据前交叉韧带切除模型中类似骨关节炎早期或中期的特点,进行模型构建[11]。采用抽签法将42只SD大鼠随机分为2组,对照组6只,造模组36只。用戊巴比妥钠对SD大鼠腹腔麻醉后,经膝关节内侧纵向切口,切断前交叉韧带,避开关节软骨面,逐层缝合关闭创口。术后每天向每只大鼠手术部位注射丁胺卡那霉素,连续3 d,笼内自由活动。术后6周大鼠膝骨性关节炎模型建立。使用HE染色观察大鼠膝关节软骨组织形态进行模型鉴定。

1.5 动物分组和药物干预

按抽签法取造模成功的大鼠18只,随机分为模型组、强骨通痹胶囊组、葡萄糖胺组,每组6只。对照组和模型组每天灌胃生理盐水,强骨通痹胶囊组用强骨通痹胶囊水溶液(7.2 mg每公斤体重)灌胃,葡萄糖胺组作为阳性对照组,用葡萄糖胺水溶液(90 mg每公斤体重)灌胃。每天给药1次,连续给药12周后,经戊巴比妥钠麻醉处死,取软骨组织。

1.6 HE染色观察大鼠关节炎软骨组织形态

使用苏木精-伊红(HE)染色法对OA大鼠进行模型鉴定。取模型大鼠膝关节于10%中性甲醛中固定48 h后放入脱钙液中脱钙,5～7 d更换一次脱钙液,45 d后查看骨组织脱钙情况,若骨能用刀切割成片时,说明脱钙已完成,否则需放入脱钙液中继续脱钙。脱钙结束的骨组织用自来水冲洗24 h后常规步骤脱水浸蜡包埋,切片厚度为3 μm,水浴展片后将切片贴附于载玻片上,然后将切片放入展片器展片,贴平粘紧后烤片。根据HE染色法对组织切片进行染色,显微镜下拍照,Leica Application Suite系统采集样本相关部位图片。

1.7 甲苯胺蓝染色观察大鼠关节炎软骨组织形态

同1.6中方法获取膝关节切片,以甲苯胺蓝染色法对组织切片进行染色,通过显微镜拍照,Leica Application Suite图像系统采集样本相关部位图片。

1.8 qRT-PCR法检测大鼠关节炎软骨组织中TLR4、NF-κB的mRNA水平

取大鼠关节炎软骨组织100 mg于放有1 mL Trizol的匀浆管中,匀浆机匀浆20 s后放于冰上裂解细胞,抽提总RNA进行反转录。再按照SYBR GREEN PCR Kit说明书进行qRT-PCR。引物序列见表1。以GAPDH作为内参,用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

表1 引物序列信息

1.9 免疫组化法检测关节炎软骨组织中TLR4、p-NF-κB水平

同1.6获取膝关节切片,二甲苯中脱蜡,水化抗原修复后进行阻断,用10%山羊血清进行封闭,先后孵育一抗(TLR4、p-NF-κB)、二抗(maxvision),经DAB和苏木精染色后,脱水、透明、封片并通过显微镜拍照,Leica Application Suite图像系统采集样本相关部位,苏木精染细胞核为蓝色,DAB阳性为棕黄色。

1.10 ELISA检测大鼠关节炎软骨组织中IL-1β、TNF-α、IL-6水平

根据IL-1β酶联免疫试剂盒,TNF-α酶联免疫试剂盒以及IL-6酶联免疫试剂盒的说明书,对各组大鼠关节炎软骨组织中IL-1β、TNF-α、IL-6水平进行检测。

1.11 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示,组间均数比较采用t检验,多组间均数比较使用单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OA大鼠模型鉴定

术后6周可观察到对照组大鼠自主活动和行走正常,模型组大鼠均可正常行走、活动,但自主活动明显较少。取大鼠关节软骨组织进行HE染色,结果(图1)显示,与对照组相比,模型组膝关节可见大量炎性细胞浸润,滑膜组织明显增厚,表明OA模型建立成功。

图1 大鼠膝关节软骨组织(HE染色,×200)

2.2 软骨组织的甲苯胺蓝染色结果

图2显示,与对照组相比,模型组软骨组织中的硫酸软骨素明显减少,呈现明显的软骨素流失状态,而强骨通痹胶囊组的硫酸软骨素虽然没有达到对照组的水平,但相比模型组有一定程度的增加。葡萄糖胺组的硫酸软骨素比起模型组则增加明显。

图中黄色箭头指向区域表示硫酸软骨素被甲苯胺蓝异染呈紫红色

2.3 软骨组织中NF-κB、TLR4 mRNA表达水平比较

各组软骨组织中的NF-κB和TLR4的表达水平均有显著差异(P<0.05)。和对照组相比,模型组的NF-κB、TLR4 mRNA表达水平都明显上升(均P<0.05);而强骨通痹胶囊组和葡萄糖胺组的NF-κB和TLR4的表达水平比起模型组则明显下降(均P<0.05),但都明显高于对照组(均P<0.05)(表2)。

表2 软骨组织中NF-κB和TLR4 mRNA表达水平比较

2.4 软骨组织的免疫组化染色结果

图3和表3显示,对照组的NF-κB和TLR4的免疫组化染色几乎呈阴性,而模型组染色明显(均P<0.05);强骨通痹胶囊组和葡萄糖胺组的NF-κB和TLR4的免疫组化染色强度比起模型组有明显减弱(均P<0.05)。

图3 各组的TLR4、NF-κB免疫组化染色结果(×200)

表3 各组免疫组化染色的平均吸光度

2.5 软骨组织中IL-1β、TNF-α、IL-6浓度比较

和对照组相比,模型组的IL-1β、TNF-α、IL-6浓度都明显上升(均P<0.05);而强骨通痹胶囊组和葡萄糖胺组的IL-1β、TNF-α、IL-6浓度比起模型组则明显下降(均P<0.05),但都明显高于对照组(均P<0.05)(表4)。

表4 软骨组织中IL-1β、TNF-α、IL-6浓度比较

3 讨论

OA属于中医学的骨痹、痹证、筋痹等范畴[12]。骨碎补气味苦、性温,归属于肝、肾经,具有补肾强骨、疗伤止痛的功效;独活则能够祛湿散寒,除痹活络止痛;而牛膝则能够强筋健骨固肝肾,这几种药材对于OA均有一定的治疗效果[13-15]。本次实验结果显示,和对照组相比,软骨组织炎症模型的硫酸软骨素明显减少,但经过强骨通痹胶囊和葡萄糖胺分别处理后,硫酸软骨素明显增多,说明强骨通痹胶囊的药效和葡萄糖胺相似,能够让软骨组织的硫酸软骨素增加,对OA有一定的治疗效果,与之前报道的中药方对关节炎的治疗效果[16]一致。

TLRs被认为是先天免疫和缺血诱导性炎症的主要因素,是组织损害的关键传感器。氧化应激会通过提高NF-κB mRNA的活性增强TLR-8介导的中性粒细胞的炎症反应[17]。氧化应激会先提高NF-κB的活性并激活其信号通路,使MyD88激活并介导TLR4胞内信号通路,最终产生促炎因子[6]。OA的发生发展与TLR4/NF-κB通路的激活关系密切,该通路的激活显著促进软骨细胞的凋亡和炎症反应[18]。当炎症因子进入细胞时,TLR4促进MyD88,进而促进NF-κB磷酸化,进一步激活炎症因子的表达[19]。本次研究发现,模型组的TLR4和NF-κB mRNA的表达水平都显著高于对照组;但在经过强骨通痹胶囊和葡萄糖胺分别处理后,TLR4和NF-κB mRNA的表达水平相较于模型组均有显著下降;免疫组化结果与之类似,模型组的TLR4和NF-κB染色明显强于对照组,但强骨通痹胶囊组和葡萄糖胺组的染色则都弱于模型组,表明强骨通痹胶囊和葡萄糖胺的功效相似,能够抑制TLR4和NF-κB的表达。

除此之外,OA的病症和与炎症相关mRNA调控的细胞因子也密切相关。根据细胞因子在软骨细胞代谢中所发挥的作用可将其分为分解性因子和合成性因子,两种因子之间维持着一种平衡,当这种平衡被打破就会导致骨关节的软骨基质被降解、破坏,从而形成骨性关节炎[20]。研究表明,TLRs被激活后,可通过MyD88活化IL-1受体相关激酶、TGF-β活化激酶,进而激发IκB激酶级联反应,激活核转录因子,从而启动与炎症免疫有关的IL-1β、TNF-α等基因的表达,产生大量IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子[21]。IL-1β和TNF-α是软骨损伤病变位置分泌的主要细胞因子,主要促进降解软骨基质的蛋白酶的合成与释放,参与了软骨损伤过程[22]。TNF-α还可参与肠道微生物紊乱造成TLR4升高的过程[23]。IL-6是一种由单核吞噬细胞分泌的具有多重生物活性的细胞因子,不但能够刺激关节滑膜内的B淋巴细胞,激活自身免疫引导,导致滑膜内发生炎性反应,还能够促进软骨基质降解破坏和抑制软骨细胞修复合成[24]。且IL-6可被TLR4的下行信号MyD88调控[19]。本次研究发现,和对照组相比,模型组的IL-1β、TNF-α、IL-6浓度明显上升;而强骨通痹胶囊组和葡萄糖胺组的IL-1β、TNF-α、IL-6浓度比起模型组则明显下降,表明强骨通痹胶囊和葡萄糖胺的药效相似,均能够抑制其中炎症因子的表达,和早前报道[25]的中药方对细胞因子的抑制效果相一致。

综上所述,强骨通痹胶囊能够通过抑制TLR4和NF-κB的表达,从而抑制炎症因子的产生,达到治疗骨关节炎的效果。提示了强骨通痹胶囊有作为治疗骨关节炎的药物的潜力,且其对于炎症因子诱发的疾病有一定的治疗效果。