牙龈卟啉单胞菌通过上调HIF-1α抑制食管鳞癌细胞铁死亡*

郭 苒, 石林林, 程月月, 陈 攀, 朱巧晴, 杜玉博, 伍当柔, 齐义军, 高社干△

1河南科技大学第一附属医院(临床医学院),肿瘤医院,河南省微生态与食管癌防治重点实验室,河南省肿瘤表观遗传重点实验室,洛阳 471003 2河南科技大学基础医学与法医学院,洛阳 471023

食管癌位居全球恶性肿瘤发病率的第7位,2020年全世界新发食管癌病例约60.4万人,其中一半以上来自中国[1-2]。在我国,食管鳞状细胞癌(食管鳞癌,esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌的主要组织学亚型,占所有食管癌病例的90%以上[3]。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一种革兰氏阴性厌氧菌,是牙周病的关键致病菌,可诱发口腔微生态失衡,造成牙周炎和牙齿缺失,与多种疾病的发生发展密切相关[4-6]。流行病学研究表明,中国食管癌高发区林州市牙齿缺失居民的ESCC发生风险显著升高[6]。还有研究报道,河南食管癌高发区ESCC患者食管癌组织P.gingivalis丰度明显高于癌旁组织,该研究认为P.gingivalis富集与ESCC侵袭转移等恶性演进显著相关,是ESCC预后的独立危险因素之一[7]。另有研究表明,P.gingivalis感染ESCC细胞后,能够显著增加ESCC细胞对顺铂、紫杉醇等化疗药物抵抗,并降低化疗药物作用后ESCC细胞的凋亡率[8]。

与坏死、凋亡等不同,铁死亡是亚铁离子依赖性,由脂质过氧化物堆积导致的一种新型细胞死亡方式[9-10]。虽然凋亡是化疗药物引发肿瘤细胞死亡、降低肿瘤负荷的主要方式,但是,化疗药物也能诱导肿瘤细胞发生铁死亡,并与化疗耐药关系密切[11]。在大肠癌[11]、胃癌[12]、胰腺癌[13]、肺癌[14]、三阴性乳腺癌[15]等多种恶性肿瘤中,铁死亡诱导剂与抗肿瘤药物的联合作用,能够通过多种方式杀伤癌细胞,更高效地清除癌细胞。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是一种具有转录活性的核蛋白,是介导缺氧状态下肿瘤细胞适应性调节的因子之一。HIF-1α可通过促进糖酵解来增加肿瘤细胞的能量供应,从而促进肿瘤细胞的增殖[16]。现有研究已表明,HIF-1α是调节铁死亡的关键蛋白之一[17-19]。然而,铁死亡在ESCC发生发展过程中的作用及机制,尤其是P.gingivalis感染对其的影响,目前尚不清楚。因此,本研究主要探讨P.gingivalis感染对ESCC细胞铁死亡的影响,以及HIF-1α抑制剂与铁死亡诱导剂联用对P.gingivalis感染阳性ESCC的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 食管鳞癌样本来源

94例ESCC组织样本来自河南科技大学第一附属医院食管肿瘤外科接受初次手术治疗的ESCC患者,所有ESCC患者术前均未接受放化疗,手术切除样本经病理学诊断为食管鳞状细胞癌,收集到的所有样本均用于免疫组化染色分析,并经过河南科技大学第一附属医院医学伦理委员会的批准。

1.2 免疫组化实验

应用PV-9000试剂盒(中杉金桥)进行组织P.gingivalis、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和HIF-1α表达水平的免疫组化检测。94例ESCC组织进行包埋、切片、烤片、脱蜡、水化,EDTA抗原修复液于100℃进行抗原修复20 min,冷却至室温后,分别加入鼠抗P.gingivalis(1∶100,ANT0085,DIATHEVA)、兔抗GPX4(1∶100,ab125066,Abcam)、兔抗HIF-1α(1∶100,ab51608,Abcam)等一抗4℃孵育过夜,抗鼠/兔二抗孵育1 h,DAB显色,苏木精复染。根据切片中胞质及胞核着色的阳性细胞数和着色强度进行免疫组化综合评分,每张切片随机选取5个视野(×200),用Image J进行定量分析,计算每个视野阳性染色的百分比,评估P.gingivalis、GPX4和HIF-1α表达的阳性率。

1.3 食管鳞癌细胞和牙龈卟啉单胞菌培养

ESCC细胞KYSE30和KYSE70由河南科技大学第一附属医院肿瘤表观遗传实验室保存,复苏后用含10% FBS(164210,Procell)的RPMI-1640(PM150110,Pricella)培养液于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养,细胞生长至80%～90%融合度时传代,取对数生长期细胞进行后续实验。P.gingivalis33277来源于美国标准菌株库ATCC,培养于含5% CO2、10% H2和85% N2的37℃厌氧培养箱中18～24 h后,取对数生长期的菌液(1×109CFU/mL,A600nm=1.5,以MOI 20感染ESCC细胞),12000 r/min、4℃离心5 min,弃去上清,PBS重悬,感染细胞。

1.4 细胞活力、细胞内丙二醛及活性氧水平测定

将对数生长期的KYSE30和KYSE70细胞接种至96孔板或10 cm细胞培养皿中,待细胞贴壁后,感染P.gingivalis,加入铁死亡诱导剂RSL3 2.5 μmol/L(1219810-16-8,MCE)和(或)HIF-1α抑制剂LW6 10 μmol/L(934593-90-5,MCE)及铁死亡抑制剂Ferrostain-1 60 nmol/L(347174-05-4,MCE)至各实验终止时(12 h或24 h)检测细胞活力,每孔加入10 μL CCK-8溶液(Invigentech),孵育2 h,酶标仪测定450 nm处的吸光度(A450nm),按公式计算细胞活力:细胞活力(%)=(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。根据丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒(BC0025,Solarbio)和活性氧(reactive oxygen,ROS)检测试剂盒(S0033S,碧云天)说明书检测并计算细胞内MDA和ROS含量。在前述分组基础上,进一步添加顺铂30 μmol/L(Cisplatin,P4394,Sigma)作为阳性对照,进行上述细胞功能评估。

1.5 平板克隆实验

取对数生长期的ESCC细胞,以500个/孔接种于6孔板中,待细胞贴壁,经P.gingivalis感染24 h后使用RSL3和(或)LW6处理,于37 ℃、5% CO2条件下持续培养14 d,弃去培养液,PBS洗涤3次,4%甲醛固定1 h,结晶紫染液染色30～60 min,PBS洗去多余染料,晾干,拍照后计数细胞克隆数。

1.6 Western blot实验

取对数生长期的细胞,以3×105个/皿接种于细胞培养皿中,待细胞贴壁后,经P.gingivalis感染处理24 h,使用RSL3或LW6处理24 h后终止实验,RIPA裂解缓冲液裂解细胞、提取蛋白,BCA法测定蛋白质浓度。SDS-PAGE分离蛋白,电转至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,分别孵育一抗GPX4(1∶1000,ab125066,Abcam)、HIF-1α(1∶1000,ab51608,Abcam)和GAPDH(1∶2500,CW0100 M,康为世纪)和相应二抗(1∶5000),ECL曝光显示目的蛋白条带,以GAPDH为参照对目的蛋白的表达进行定量。

1.7 qRT-PCR检测

取对数期生长的ESCC细胞,分组处理后,以Trizol(15596026,Invitrogen)提取总RNA,按HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(R211,Vazyne)操作说明,反转录合成cDNA,用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q111,Vazyne)进行PCR,检测HIF-1α及其靶基因脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂肪酸结合蛋白7(FABP7)的mRNA水平,用2-ΔΔCt方法计算每个基因的相对表达量。引物序列详见表1。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.8 免疫荧光实验

将对数生长期的ESCC细胞以8×103个/皿接种于共聚焦培养皿中,以P.gingivalis感染24 h,洗涤、甲醛固定、透化、封闭,孵育HIF-1α一抗(1∶100,ab51608,Abcam)和荧光标记的二抗,DAPI复染细胞核,共聚焦显微镜下观察、拍照。

1.9 动物实验及分组

取6～8周龄BALB/c-nu雄性裸鼠(北京维通利华),体重18～20 g,共34只。于裸鼠右侧后背部皮下接种经P.gingivalis以MOI 20感染24 h和未感染的KYSE70细胞(3×106/只),皮下荷瘤长至100 mm3后,分为对照组、P.gingivalis感染组、RSL3组、P.gingivalis和RSL3联合处理组、P.gingivalis和RSL3及LW6联合处理组,每组6只。RSL3处理组及LW6处理组按同等剂量采取腹腔注射(50 mg/kg,溶剂为40% PEG300),一周2次,每次100 μL;联合处理组相应药物给药方式同上所述,28 d实验终止。实验过程中测量肿瘤大小(最大长径a和最小短径b),实验终止时剥离瘤体称重并计算瘤体体积(a×b2/2)。

1.10 统计学方法

用SPSS 26.0和Graphpad Prism软件进行数据统计分析,检验水准α=0.05。实验数据以均数±标准差表示,Western blot与PCR结果的差异分析采用t检验,P.gingivalis丰度和HIF-1α蛋白表达的相关性分析采用卡方检验,实验终点的肿瘤生长曲线采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 P.gingivalis抑制食管鳞癌细胞发生铁死亡

为研究P.gingivalis感染对ESCC细胞铁死亡过程的影响,本研究首先对KYSE30和KYSE70细胞进行P.gingivalis感染,然后加入铁死亡诱导剂RSL3处理,通过CCK-8检测不同处理组的细胞活力。结果显示,P.gingivalis感染显著促进KYSE30和KYSE70细胞增殖;RSL3处理显著抑制KYSE30和KYSE70细胞增殖,加入铁死亡抑制剂Ferrostain-1后,RSL3对ESCC细胞的增殖抑制作用减弱;P.gingivalis感染也可显著降低RSL3对ESCC细胞的增殖抑制作用(均P<0.05,图1A、1B)。

1:Uninfected;2:P.gingivalis;3:RSL3;4:RSL3+P.gingivalis;5:RSL3+Ferrostain-1;6:positive control;A:CCK-8检测细胞活力;B:平板克隆实验检测细胞增殖;C:化学法检测细胞中MDA含量;D:流式细胞术检测细胞ROS含量;E:Western blot检测细胞蛋白表达水平;F:免疫组化实验检测ESCC组织中GPX4的表达(×200);*P<0.05,**P<0.01

检测ESCC细胞经P.gingivalis和(或)RSL3处理后铁死亡的标志性代谢产物MDA(图1C)和ROS(图1D)含量的变化。结果表明,RSL3处理KYSE30和KYSE70细胞后,细胞内MDA和ROS含量显著升高;P.gingivalis感染后,接受RSL3处理的KYSE30和KYSE70细胞中MDA和ROS含量降低(均P<0.05,图1C、1D)。Western blot结果表明,与RSL3单独处理组相比,P.gingivalis感染可显著升高KYSE30和KYSE70细胞中铁死亡核心调控蛋白GPX4的蛋白表达水平(图1E),提示P.gingivalis对ESCC细胞铁死亡起抑制作用。免疫组化检测ESCC组织中GPX4蛋白表达,发现P.gingivalis感染的ESCC组织中GPX4蛋白表达也增高(P<0.05,图1F)。

2.2 P.gingivalis感染上调食管鳞癌中HIF-1α的表达水平

免疫组化结果显示,P.gingivalis感染阳性(40.4%,38/94)的ESCC组织样本中HIF-1α表达阳性率显著升高(78.9%,30/38),且P.gingivalis感染阳性与ESCC组织中HIF-1α高表达阳性率显著相关(χ2=13.2,P<0.01)(图2A)。接下来,分别从基因和蛋白水平检测了P.gingivalis感染KYSE30和KYSE70细胞后HIF-1α的表达情况。结果显示,P.gingivalis感染显著提高KYSE30和KYSE70细胞中HIF-1α的表达水平(图2B、2C)。此外,免疫荧光结果显示P.gingivalis感染可显著促进ESCC细胞核周HIF-1α的聚集(图2D)。进一步通过qRT-PCR检测P.gingivalis感染对KYSE30和KYSE70细胞HIF-1α下游靶基因表达的影响。结果显示,P.gingivalis感染可显著提高HIF-1α下游靶基因FABP3和FABP7的mRNA表达水平(图2E)。

A:免疫组化检测P.gingivalis高、低丰度ESCC组织中HIF-1α表达情况(×200);B:qRT-PCR检测ESCC细胞感染P.gingivalis后HIF-1α mRNA表达量变化;C:Western blot检测ESCC细胞感染P.gingivalis后HIF-1α蛋白表达量变化;D:免疫荧光检测ESCC细胞感染P.gingivalis后细胞中HIF-1α分布变化;E:qRT-PCR检测ESCC细胞感染P.gingivalis后HIF-1α靶基因FABP3和FABP7的表达情况;*P<0.05,**P<0.01

2.3 HIF-1α介导P.gingivalis诱导的ESCC细胞铁死亡抗性

为明确HIF-1α在P.gingivalis感染的KYSE30和KYSE70细胞发生铁死亡过程中的作用,本研究首先用HIF-1α抑制剂LW6单独处理ESCC细胞,发现LW6能够明显抑制HIF-1α蛋白表达;而与LW6单独处理组相比,P.gingivalis感染联用LW6组的HIF-1α蛋白表达未见明显上调(图3A)。进一步,与P.gingivalis+RSL3处理组相比,同时应用HIF-1α抑制剂LW6联合处理后,ESCC细胞活力降低,MDA水平升高,说明LW6能够抑制P.gingivalis感染所诱导的细胞增殖,同时降低铁死亡抗性(图3B～3D)。

1:Uninfected;2:P.gingivalis;3:RSL3;4:RSL3+P.gingivalis;5:RSL3+LW6;6:RSL3+LW6+P.gingivalis;7:Cisplatin;8:Cisplatin+P.gingivalis;9:Cisplatin+LW6;10:Cisplatin+LW6+P.gingivalis;A:Western blot检测HIF-1α的蛋白表达水平;B:CCK-8检测细胞活力;C:平板克隆实验检测细胞增殖;D:化学法检测细胞MDA含量;E:Western blot检测GPX4蛋白表达;F:P.gingivalis感染对顺铂作用的影响;*P<0.05,**P<0.01

Western blot结果显示,在P.gingivalis感染基础上,LW6和RSL3联合使用较RSL3单独处理组GPX4蛋白的表达量降低,提示LW6处理可逆转P.gingivalis感染诱导的ESCC细胞铁死亡抗性(图3E)。与文献报道一致[12],P.gingivalis感染可以降低顺铂对ESCC细胞的敏感性,而同时使用LW6可靶向抑制HIF-1α进而改善P.gingivalis诱导的铁死亡抗性,从而增强顺铂对ESCC细胞的杀伤作用(图3F)。

2.4 P.gingivalis感染影响HIF-1α表达抑制RSL3抗肿瘤疗效的体内实验

为了进一步在体内验证P.gingivalis感染上调HIF-1α从而抑制ESCC细胞铁死亡的作用,本研究采用经P.gingivalis感染的KYSE70细胞建立裸鼠皮下荷瘤模型,再分别给予RSL3单独或联合LW6处理。

结果表明,与对照组相比,P.gingivalis感染可显著促进荷瘤小鼠肿瘤体积的增长[(582.0±16.1)mm3vs.(881.0±14.7)mm3,P<0.05];与RSL3单独处理[(456.0 ±8.3)mm3]相比,P.gingivalis感染能够降低RSL3的抑瘤作用[(508.0±14.8)mm3],上述作用可被LW6联合作用[(315.0±12.4)mm3]显著抑制(图4)。

3 讨论

P.gingivalis是ESCC发生、发展过程中的重要危险因素之一[7]。研究提示,ESCC组织中P.gingivalis丰度与肿瘤淋巴结转移、浸润深度、TNM分期和总生存期缩短呈显著正相关[7-8]。新辅助放化疗联合食管切除是可手术切除ESCC患者首选的治疗方式,患者生存获益优于单纯手术治疗[20-21]。多烯紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶(5-Fu)是目前临床常用的ESCC化疗药物,大部分初治的ESCC患者对这些化疗药物敏感,但化疗过程中发生的化疗耐药导致超过70%的ESCC患者治疗失败,5年生存率低于30%[22-23]。P.gingivalis感染KYSE30细胞后,通过STAT3激活Caspase 3,降低了紫杉醇、5-Fu和顺铂诱导的KYSE30凋亡发生率,表明P.gingivalis感染降低了ESCC细胞对化疗药物的敏感性,进而诱导化疗耐药。P.gingivalis阴性ESCC患者总生存期>60个月,而P.gingivalis阳性患者仅为26个月[8]。此外,P.gingivalis还可通过调控溶质运载蛋白7家族成员11来促进P.gingivalis在胞内的定植,从而促进ESCC细胞的增殖[24]。因此,P.gingivalis刺激的ESCC细胞增殖和抗凋亡能力增强是ESCC患者预后不良的重要危险因素。

铁死亡具有特征性的形态学、生化特征和分子学基础,是与凋亡、坏死和自噬不同的细胞死亡方式,且凋亡、坏死和自噬的小分子抑制剂不能阻断铁死亡的发生,铁死亡为肿瘤的治疗提供了新的选择[9]。多数的化疗药物是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡清除肿瘤细胞,而顺铂不仅能够诱导A549和HCT116细胞凋亡,还能降低胞内谷胱甘肽含量和灭活谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs),诱导这两种癌细胞发生铁死亡[11]。一些小分子化合物如Erastin和RSL3通过抑制胱氨酸-谷氨酸交换系统Xc-或GPX4诱导细胞发生铁死亡[9-11,25]。本研究表明,P.gingivalis感染ESCC细胞后,细胞内ROS和MDA降低,GPX4表达升高,进而降低RSL3诱导的KYSE30和KYSE70细胞铁死亡,提示P.gingivalis可能通过多种机制与感染的宿主细胞共存,促进肿瘤进展。

低氧广泛存在于细胞和组织中,尤其是肿瘤组织中,缺氧诱导因子(HIF)是细胞感受和适应组织低氧的重要机制之一。HIF包括HIF-1α、HIF-2α及HIF-3α,其中HIF-1α的表达受氧含量调节[26]。由于恶性肿瘤生长迅速,恶性肿瘤组织长期处于低氧状态,为了适应低氧环境,HIF-1α在多种不同类型的恶性肿瘤细胞中表达增加[27]。HIF-1α能够诱导多种血管生长因子的表达,如血管内皮生长因子和血管生成素1/2[28],促进肿瘤血管形成。缺氧状态下,ESCC细胞中HIF-1α表达增加,继而促进葡萄糖转运蛋白-1及己糖激酶-Ⅱ等糖酵解相关酶表达,表明HIF-1α能够通过促进糖酵解来增加肿瘤细胞的能量供应,促进肿瘤细胞的增殖[29]。有研究证实,HIF-1α表达下调可以促进RSL3诱导的铁死亡过程[18]。且在缺氧条件下HIF-1α诱导的FABP3和FABP7表达对脂质储存至关重要[30],与细胞膜的脂质过氧化有关。另有研究表明,P.gingivalis感染能够干扰牙膜周细胞中糖酵解和三羧酸循环通路相关基因的表达,并降低脯氨酸羟化酶2(prolyl hydroxylase 2,PHD2)和核转录因子红系2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)表达,抑制PHD2依赖的HIF-1α降解。本研究结果证实,P.gingivalis诱导ESCC细胞中HIF-1α表达上调,介导铁死亡抗性产生,HIF-1α抑制剂LW6能够逆转P.gingivalis诱导的ESCC细胞铁死亡抗性,提示HIF-1α是克服ESCC耐药的潜在靶点分子。

综上所述,本实验证实P.gingivalis可通过上调ESCC中HIF-1α的表达,介导ESCC细胞铁死亡抗性发生,抑制HIF-1α能够恢复P.gingivalis感染的ESCC细胞对铁死亡诱导剂的敏感性,是克服ESCC多重耐药的潜在靶点分子。