合成树脂类材料的细胞毒性方法差异性分析

钟文雨，黄虹蓉，杨安然，孔怡然，林钟石

(深圳市医疗器械检测中心，广东 深圳 518000)

0 引言

医疗器械是指单独或者组合使用于人体的仪器、设备、器具、材料或者其他物品，也包括所需要的软件[1]，其安全性与人民健康和社会安全都具有紧密联系[2]。一次性医疗用品大多数由高分子聚合物即合成树脂类制作而成[3]，合成树脂具有许多优异的性能，可以制造成塑料假肢、合成树脂牙等[4]，被广泛用于医疗的各个领域。市面上合成树脂类一次性医疗用品种类越来越丰富，但也大大增加了其与人体暴露的风险。因此，合成树脂类材料的医疗器械的临床前安全性评价就尤为重要，选择适宜的检测方法可以有效地缩短医疗器械的临床前评价研究时限以及节省研究成本。体外细胞毒性试验作为目前医疗器械进行临床前安全性评价的首选和必选试验项目[5]，其具有研究周期短、敏感性高、节省经费的优势[6]。其中的浸提液实验是目前较为广泛的用于检测医疗器械的细胞毒性的方法，其定量评价方法相对于定性评价方法更具有客观性。

在GB/T 16886.5—2017 中体外细胞毒性试验的定量评价方法包含中性红摄取法、集落形成法、MTT 比色法以及XTT 比色法[7]。这四种试验方法的机理存在不同之处，如何按照标准要求来选择适宜的细胞毒性试验方法，是目前医疗器械注册前的一大难点。本实验根据GB/T 16886.5—2017 附录中提供的中性红摄取法、集落形成法、MTT 比色法以及XTT 比色法四种定量试验方法，选择医疗领域中使用率较高的PE、PP、PS 和PVC 四种合成树脂类材料作为代表，评价分析合成树脂类材料在四种不同试验方法下的细胞毒性结果的差异性，以此为选择适宜的细胞毒性检测方法提供一定的数据支持。

1 实验材料与方法

样品前处理参照GB/T 16886.12—2017，PE 材料、PP 材料、PS 材料和PVC 材料按照0.2 g/mL 的浸提比例制备样品浸提液。

1.1 中性红摄取法

1.1.1 材料

BALB/c 3T3 细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；DMEM 培养基、新生小牛血清(GIBCO)；乙醇、乙酸(广州化学试剂厂)；中性红染料(SIGMA)。

1.1.2 实验步骤

将BALB/c 3T3 细胞按照1×104个细胞/100 µL 接种在96 孔板孔中，置于5% CO2培养箱37 ℃培养24 h后弃去原培养液，分别加入空白对照溶液、阳性对照溶液、样品浸提液。在培养24 h 后，小心弃去原培养液，用100 µL 预热的PBS 冲洗后，每孔加入100 µL 的中性红培养基再孵育3 h。然后弃去中性红培养基，150 µL PBS冲洗后，每孔再加入150 µL 中性红洗脱液，在酶标仪540 nm 波长下测定吸光度并计算细胞相对活力。

1.2 集落形成法

1.2.1 材料

V79 细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；MEM 培养基、胎小牛血清(GIBCO)；吉姆萨染液(珠海贝索)。

1.2.2 实验步骤

将V79 细胞按照100个细胞/13 mL 接种在6 孔板孔中，置5% CO2培养箱37 ℃培养24 h 后弃去原培养液，分别加入2 mL 的空白对照溶液、阳性对照溶液、样品浸提液。培养6 d 后，弃去原培养液，用PBS 冲洗后，加入甲醇固定集落，再用5%吉姆萨染液染色后，计算每一孔的集落数目，并计算每个组别的PE 值。

1.3 MTT 比色法

1.3.1 材料

L-929 细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会 细 胞库)；MEM 培 养 基、胎 小 牛 血清(GIBCO)；

MTT(SIGMA)。

1.3.2 实验步骤

将L929 细胞按照1×104个细胞/100 µL 接种在96 孔板孔中，置5% CO2培养箱37 ℃培养24 h 后弃去原培养液，分别加入空白对照溶液、阴性对照浸提液、阳性对照、样品浸提液，每组设置6 个复孔。在培养24 h 后，倒置显微镜下检查无异常后，小心弃去原培养液，每孔加入50 µL 的MTT 溶液再孵育2 h。然后弃去MTT 溶液，每孔加入100 µL 异丙醇，在酶标仪570 nm 波长(参比波长650 nm)下测定光密度并计算存活率。

1.4 XTT 比色法

1.4.1 材料

L-929 细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细 胞库)；MEM 培 养基、胎 小 牛 血清(GIBCO)；XTT、PMS(SIGMA)。

1.4.2 实验步骤

将L929 细胞按照1×104个细胞/100 µL 接种在96 孔板孔中，置5% CO2培养箱37 ℃培养24 h 后弃去原培养液，分别加入空白对照溶液、阴性对照浸提液、阳性对照以及样品浸提液，每组设置6 个复孔。在培养24 h 后，倒置显微镜下检查无异常后，每孔加入50 µL的XTT/PMS 溶液再孵育4 h。振荡混匀后从每孔取出100 µL 等份液体至新的孔板对应孔中，在酶标仪450 nm波长(参比波长630 nm)下测定吸光度并计算存活率。

2 结果判定条件

以上四种不同定量试验方法，均采用结果数值70%为界限判定样品的细胞毒性。每种方法对应的测定条件以及判定条件如表1 所示。

表1 不同方法的细胞毒性测定条件及判定

3 实验结果

4 种不同的试验样品分别在四种定量试验方法下测定细胞毒性，中性红摄取法、集落形成法、MTT 比色法及XTT 比色法的细胞毒性详细结果如表2 所示。

表2 受试样品在不同实验方法下的细胞毒性结果

本实验结果表明，合成树脂类材料在这四种不同实验方法下，表现出的细胞毒性结果无显著性差异，结果具有一致性。

4 讨论

PE 是一种通过乙烯聚合制备得到的高性能树脂，由于其优良的机械强度和生物相容性以及无味、无毒、植入体内无不良影响等优势，低密度PE 可用于制造薄膜和包装袋等；高密度PE 则用于制造人工脏器、人工关节、矫形外科修补材料等；超高分子量PE 在骨科和心血管植入领域得到普及[8]。PP 是丙烯聚合制备得到的材料，主要用于制造医用导管、输液容器等，也可经表面活性剂处理后制成人工肺等[9]。PS 是苯乙烯单体自由基加聚合成而得到的透明、热塑性合成树脂[10]，主要用于制造医疗用瓶、注射器托盘和包装材料等。PVC 是由氯乙烯在引发剂作用下聚合而成的热塑性合成树脂，具有良好的力学性能且耐寒、柔软、透明[11]，主要用于输血袋、输液袋、体外循环装置导管、鼓泡式氧合袋、尿袋等与人体短期接触的制品。由此可见，合成树脂在医用耗材、治疗性器械、植入性器械等多个方向都具有不可忽视的地位，因此其临床前生物安全性评价是必不可少的。

通过细胞毒性定量检测方法，可以客观地测量细胞数量、蛋白质总量、酶释放、活体染料释放以及还原等参数，其灵敏度和判定限都比定性评价更高，而且受到试验者个人主观因素的影响也更小。然而，定量的试验方法中也各有优势和不足。中性红摄取法是检测溶酶体完整性，具有灵敏度高、重现性好、高通量的优点[6]，但诱发溶酶体肿胀的物质会干扰实验结果而出现假阴性[12]；集落形成法通过细胞增殖能力表现细胞毒性，这种增殖能力在死细胞或不再具备分裂能力的细胞上是丧失的[13-14]，但受实验操作人员的主观因素影响较大且耗时长；MTT 和XTT 比色法实验原理相同，都是通过降解活细胞内的线粒体脱氢酶来反映细胞毒性[15]，但生成的有色物质不同，MTT 比色法产生的甲臜需要通过裂解细胞以溶解测定，XTT比色法减少了人为操作误差[16]，但XTT 试剂相较于MTT 成本较高，大大增加了试验成本。

本试验通过对PE、PP、PS、PVC 这四种材料进行中性红摄取法、集落形成法、MTT 比色法及XTT 比色法测定细胞毒性，均未表现出细胞毒性，因此这四种树脂材料选择任一定量测定方法均可测定。但在生产工艺过程中，原材料需要经过一系列的切割、黏合等操作后才能成为最终产品，这些过程中也许会产生新的致使细胞毒性的物质仍未可知。因而，在选择细胞毒性的定量试验方法时，仍然需要根据产品本身的特性选择适当的方法。原材料的细胞毒性虽然不能代表生产的最终产品的细胞毒性，但可以作为优化产品的思路，节省产品研发成本。