双砧木嫁接对西瓜根际土壤生物学性状及细菌群落结构的影响

郭 松，于 蓉，董 瑞，李 程，田 梅

（宁夏农林科学院园艺研究所 银川 750002）

土壤中微生物种群和数量是土壤微生态环境的重要组成部分。西瓜根际土壤中的微生态环境与枯萎病等土传病害的抗性机制密切相关。西瓜枯萎病等土传病害的发生概率及危害程度受到土壤中微生物种群比例的影响[1-2]。土壤微生物群落中细菌群落结构占比70%以上，其在养分循环、防控土传病害等方面发挥重要作用[3]。西瓜嫁接处理后，砧木和西瓜接穗的互作会影响根系分泌物，使土壤中的微生物组成发生变化[4-5]。

西瓜嫁接技术比较广泛地应用到生产中，其对根际土壤微生物数量和群落结构等方面的研究已有报道[6-7]，但对双砧木嫁接和中间砧嫁接的西瓜植株根系微生物结构等方面的研究鲜有报道[8]。根际土壤微生物与连作存在着密切关系，也会影响到微生物生物量的积累、土壤酶活性及根系分泌物的释放[9]。通过优良砧木嫁接调节根际土壤的微生物种群结构，也是克服西瓜连作障碍的有效途径。有研究表明，嫁接根系分泌物可降低土壤酶活性；抗性砧木与接穗之间存在着互作效应，土壤微生物群落影响着根际病原菌的数量[10-12]。因此，笔者通过检测分析两种西瓜嫁接处理的根际土壤生物学性状及细菌群落结构，以期揭示双砧木嫁接、中间砧嫁接增强植株抗性的机制，为进一步有效利用双砧木嫁接技术防控土传病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的西瓜品种为宁农科1 号（由宁夏农林科学院园艺研究所提供），砧木为白籽南瓜品种早生西砧（购于宁夏银川市西北农资城）和野生西瓜（所用材料PI 189225 由国家园艺种质资源库提供）。

1.2 试验设计

试验于2021 年2-8 月在宁夏吴忠市利通区高闸瓜菜试验基地开展。试验田前茬作物为水稻，土壤有机质含量（w，后同）19.10 g·kg-1、碱解氮含量83.20 mg·kg-1、有效磷含量22.50 mg·kg-1、速效钾含量137.30 mg·kg-1、全氮含量1.27 g·kg-1、全磷含量0.93 g·kg-1、全钾含量49.50 g·kg-1、pH 为8.12，地力水平中等。

试验采用单因素随机区组设计，采用南瓜和野生西瓜双根砧嫁接（以下简称“双砧嫁接”）、白籽南瓜为根用砧木且野生西瓜作为中间砧嫁接（以下简称“中间砧嫁接”）2 种多砧木嫁接方式（如图1），设置南瓜单砧木的常规嫁接为对照组CK，试验小区采用完全随机排列，设3 次重复，每个重复30 株，共9个小区，每个小区35 m2，株行距30 cm×2.0 m。生物菌剂按3 kg·hm-1与羊粪6000 kg·hm-1混合均匀，预湿后于2 月25 日施入定植行内。3 月10 日定植，田间管理同常规生产。

图1 不同砧木嫁接处理示意图Fig.1 Different stock grafting treatment diagram

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤样品采集方法 西瓜成熟采收后，采集各处理表层0～20 cm 的土样，采样时每个处理随机采集12 株西瓜的根际土壤混样，重复采样3 次获得3 个分析样品。样品过筛（40 目）后迅速装入无菌自封袋密封，运至实验室检测土壤生物学性状及细菌群落结构。

1.3.2 土壤微生物群落的测定方法 各处理根际土壤在培养基上进行培养后，采用稀释平板法测定微生物数量；细菌群落结构基于高通量测序分析完成。采用容量分析法测定微生物生物量碳；采用茚三酮比色法测定微生物生物量氮；采用磷钼蓝比色法测定微生物生物量磷。采用Hayano 的方法[13]测定β-葡糖苷酶活性，采用Ladd 的方法[14]测定氨肽酶活性，采用Bremner 的方法[15]测定磷酸酶活性。

1.4 数据统计分析

采用邓肯氏新复极差检验法对数据进行多重比较分析。利用R 语言v 4.1.3 进行植株根际土壤细菌多样性分析。

2 结果与分析

2.1 双砧嫁接对根际土壤微生物生物学性状的影响

2.1.1 不同嫁接处理微生物数量的变化 由表1可知，中间砧嫁接和双砧嫁接处理的根际土壤中细菌数量均显著高于单砧嫁接对照，双砧嫁接西瓜处理的细菌数量与中间砧嫁接处理的差异不显著。双砧嫁接西瓜的根际土壤中的放线菌数量显著高于其他两个处理，比CK 提高36.64%。

表1 双砧木嫁接对西瓜根际土壤微生物数量的影响Table 1 Effect of double rootstock grafting on the microbial quantity of watermelon rhizosphere soil（×106CFU·g-1）

2.1.2 不同嫁接处理土壤生物量的变化 由表2可知，3 种嫁接处理的根际土壤中微生物生物量碳和氮含量均表现为双砧嫁接＞中间砧嫁接＞单砧嫁接对照，且3 种嫁接处理之间均存在显著差异。3 种嫁接处理的根际土壤中微生物生物量磷含量表现为双砧嫁接＞单砧嫁接＞中间砧嫁接，双砧嫁接处理显著高于其他2 个处理，中间砧嫁接与单砧嫁接对照处理无显著差异。由此可以看出，双砧嫁接处理有助于富集根际土壤中3 种微生物生物量。

表2 双砧嫁接对西瓜根际土壤生物量碳、氮、磷含量的影响Table 2 Effects of double stock grafting on biomass C，N，P in watermelon rhizosphere soil （mg·kg-1）

2.1.3 不同嫁接处理土壤酶活性的变化 由表3可知，双砧嫁接处理的根际土壤中β-葡糖苷酶、氨肽酶、磷酸酶活性均显著高于单砧嫁接处理。中间砧嫁接和双砧嫁接处理间β-葡糖苷酶、氨肽酶活性差异显著，但二者间磷酸酶活性无显著差异。中间砧嫁接处理的β-葡糖苷酶、氨肽酶活性与单砧嫁接对照差异不显著，但其磷酸酶活性显著高于单砧嫁接对照处理，中间砧嫁接和双砧嫁接处理间磷酸酶活性差异不显著。由此可以看出，双砧嫁接有助于提高根际土壤相关酶活性，根际土壤β-葡糖苷酶、氨肽酶、磷酸酶活性分别比CK 提高9.01%、16.07%和13.14%。

表3 双砧木嫁接对西瓜根际土壤酶活性的影响Table 3 Effects of grafting on enzyme activities in watermelon rhizosphere soil （nmol·g-1·min-1）

2.2 双砧木嫁接对根际土壤细菌群落结构的影响

2.2.1 不同处理对根际土壤细菌多样性的影响由表4 可知，3 个处理的样本文库覆盖率均在98.1%以上，结果可代表真实情况。双砧嫁接处理除辛普森指数显著低于单砧嫁接和中间砧嫁接处理外，其他3 个指数均显著高于单砧嫁接和中间砧嫁接处理，但中间砧嫁接和单砧嫁接处理的4 个指数之间均无显著差异。表明双砧嫁接处理可显著提高细菌的丰富度。

表4 不同嫁接处理根际土壤细菌的多样性指数Table 4 Diversity index of rhizosphere soil bacteria under different grafting treatments

2.2.2 不同处理的细菌门分类水平的优势菌群分析 分析不同处理的细菌门分类水平结构可知，在单砧嫁接、中间砧嫁接和双砧嫁接3 个处理根际土壤中，共有的优势细菌门有12 个。由表5 可知，3个处理中的变形菌门占比最高，分别占比达30.24%、33.04%、32.32%，其次是酸杆菌门、绿弯菌门、放线细菌门，这4 个优势细菌门占比均超过10%以上。

表5 不同处理的细菌门分类水平结构占比Table 5 Proportion of bacterial phylum classification level structure under different treatments %

各处理间酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloreflexi）占比差异不显著。中间砧嫁接处理中的变形菌门（Proteobacteria）、放线细菌门（Actinobacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、匿杆菌门（Latescibacteria）占比显著高于单砧嫁接对照处理；但单砧嫁接对照处理中的厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）占比却显著高于中间砧嫁接处理。双砧嫁接处理中的厚壁菌门（Firmicutes）占比与对照处理差异不显著；但双砧嫁接处理中的变形菌门（Proteobacteria）、螺旋体菌门（Saccharibacteria）占比显著高于单砧嫁接，说明嫁接改变了这几个优势细菌门的占比。

2.2.3 基于属分类水平的优势菌群分析 由表6可知，有10 个优势细菌属占比大于1%。对细菌属分类水平共有优势细菌结构占比分析发现，norank_c_Acidobacteria 在根际土壤中占比最高，中间砧嫁接处理占比为7.04%，双砧嫁接处理占比为5.43%。其中，单砧嫁接植株根际土壤中芽孢杆菌属（Bacillus）的占比为4.36%，显著高于中间砧嫁接（2.96%）和双砧嫁接（2.93%）。

表6 细菌属分类水平共有优势细菌结构占比Table 6 Proportion of dominant bacterial structures at the classification level of bacterial genera %

双砧嫁接处理的norank_f_Xanthobacteraceae、norank_o_SC-I-84、norank_f_Nitrosomonadaceae 占比显著高于中间砧嫁接和单砧嫁接处理；中间砧嫁接处理中的norank_c_Acidobacteria、硝化螺菌属（Nitrospira）、norank_o_Gaiellales 占比显著高于其他两个处理。但各处理间的norank_f_Anaerolineaceae 占比差异不显著。

2.2.4 基于OTU 水平的Venn 分析 通过统计不同处理样本中所共有及独有的可操作性分类单元数量并绘制Venn 图。由图4 可知，西瓜单砧嫁接、中间砧嫁接和双砧木嫁接3 个处理的根际土壤中细菌总OTU 数量分别为1895、2076 和2246。其中，共有的OTU 数量为1794，西瓜单砧嫁接、中间砧嫁接和双砧木嫁接处理的根际土壤中特有的细菌OTU 数量分别为12、53 和204。结果表明，双砧嫁接和中间砧嫁接均能够明显增加西瓜根际土壤中特有的优势细菌数量，这可能是嫁接提高抗性的主要机制。

图4 细菌OTU 分类水平Venn 图Fig.4 Venn plot of bacterial OTU classification level

3 讨论与结论

笔者在试验中发现，双砧嫁接处理的根系分泌物较自根西瓜显著抑制病菌群落的生长，尤其是双砧嫁接提高了西瓜土壤磷酸酶活性和微生物数量，具有抑制菌丝生长的化感物质，这与尹玉玲等[9]在茄子上的研究一致。且双砧嫁接处理有助于富集根际土壤中微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物生物量磷，表明砧穗间存在着互作效应，但在向接穗传递过程中有一定程度的降低，这与符厚隆等[10]在冬瓜嫁接试验中的结果相近。双砧木嫁接处理和中间砧嫁接处理根际土壤中碳、氮、磷含量均显著高于单砧嫁接处理，且能够改善西瓜根际土壤微环境，提高根际土壤相关酶活性。但双砧嫁接对西瓜枯萎病菌（尖孢镰刀菌数量）的影响差异还需进一步研究。

除微生物生物量磷无显著差异外，双砧嫁接处理碳、氮表现显著高于中间砧嫁接西瓜处理。与西瓜单砧嫁接处理相比，中间砧嫁接和双砧嫁接改变了这几个优势细菌门的占比，比如变形菌门、放线细菌门、硝化螺旋菌门等。同时，双砧嫁接拥有丰富的特有OTU 数量及不同占比的共有优势细菌门属。砧木与接穗通过相互调节，缓解胁迫因子的伤害，可能是双砧嫁接提高抗性的主要机制[11-12]。

本研究结果表明，双砧嫁接处理根际土壤中微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物生物量磷含量均显著高于其他处理；双砧嫁接处理根际土壤中特有分类操作单元OTU 数量为204，微生物菌门有2 个，分别为变形菌门（Proteobacteria）、螺旋体菌门（Saccharibacteria），不同占比的共有优势细菌门属为norank_f_Xanthobacteraceae、norank_o_SC-I-84、norank_f_Nitrosomonadaceae。中间砧嫁接处理根际土壤微生物群落的覆盖度较大，但其丰富度与群落多样性低于双砧嫁接处理。中间砧嫁接处理根际微生物生物量也发生了改变，砧木根系分泌物富集并改变了土壤细菌门属。与之相比，双砧嫁接处理根际土壤物质代谢旺盛，提高了西瓜根际土壤养分有效性，根际土壤磷酸酶等酶活性也得到提高，改善了根际土壤微环境。本研究为进一步研究抗性机制和双砧木嫁接技术的利用提供了理论依据。