化学发光法定量检测抗双链DNA IgG 抗体的方法学性能验证

王丽娟，路颖，韩燕聪，刘妮妮

抗双链DNA IgG 抗体（Anti-dsDNA IgG）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， SLE）的特异性抗体，存在于SLE 患者的血清中。相关研究指出该抗体的滴度与SLE的活动性存在相关性，并与狼疮性肾小球肾炎的发病密切相关［1-4］。美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）已将Anti-dsDNA IgG 阳性作为SLE 患者的重要诊断标准之一［5-6］。大量实践表明，Anti-dsDNA IgG 检测对于SLE 患者的早期诊断和治疗具有重要意义［7-8］。目前临床实验室检测Anti-dsDNA IgG 的方法主要有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法、放射免疫法和化学发光免疫分析法等。其中化学发光免疫分析法操作简便、无放射性、检测速度快、灵敏度高等，近几年与该类检测相关的设备得到较快发展［9-10］。本研究主要参考美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）的系列标准文件、中国合格评定国家认可委员会（China National Accreditation Service for Conformity Assessment， CNAS）的相关应用说明和指南，以及Anti-dsDNA IgG 测定试剂盒说明书，对Maglumi2000 P 检测系统检测Anti-dsDNA IgG 的性能进行验证，以明确其是否满足实验室用途和临床需求，为SLE 患者寻求Anti-dsDNA IgG 定量检测的可靠方法。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2021 年4-6 月海军第九七一医院开展Anti-ds-DNA IgG 检测的血清样本66 份，2019-2020 年国家卫生健康委临床检验中心的Anti-dsDNA 室间质评标本共20 份，以及健康体检正常血清标本20 份。

1.2 仪器和试剂

本研究采用的仪器和试剂为深圳新产业生物医学工程股份有限公司的Maglumi2000 P 检测系统，配套Anti-ds-DNA IgG 测定试剂盒（批号：129210111）、校准品（批号：129210111）和质控品（批号：129210111）。

1.3 方法

1.3.1 精密度验证 参照CLSI 的EF15-A2 方案［11］，采用高、低2 个水平的质控品（一个生理水平，一个病理水平）进行精密度验证；在检测系统处于优良的条件下，2 组质控品分别分装5 管，2～8 ℃冷藏保存。每天取1 管上机连续检测3 次，连续5 d，计算平均值及变异系数CV，得到中间精密度及重复性精密度。最后与厂家声明的精密度进行比较，低于厂家说明书声称的数值，则验证通过。

1.3.2 准确度验证 （1）回收率实验：参照CLSI 的EF9-A2方案［11］，选择合适浓度的低值检测样本，其中取1 份900 µl低值检测样本加入已知浓度为800 IU/ml 的校准品100 µl制成回收分析样本。在另一份同等浓度900 µl 低值检测样本中加入100 µl 无待测分析物的校准品S0，制成基础样本。每个样本检测3 次，计算均值浓度，按如下公式计算回收率：

式中，R为回收率，V为加入的校准品体积，V0为低值检测样本的体积，C为回收分析样本的浓度均值，C0为基础样本的浓度均值，Cs 为校准品的浓度。

厂家声称的数值在90%～110%范围内。

（2）符合率验证（每个样本重复检测不少于3 次）：与国家卫生健康委临床检验中心的Anti-dsDNA IgG 质评物进行比对，20 份标本中，有19 份及以上符合，则验证通过。

1.3.3 检出限验证 采用S0校准品重复测定20 次，计算平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD，代入工作曲线，求出相应的浓度值，即为检出限。

1.3.4 线性范围验证 选取高浓度（800 IU/ml）和低浓度（0.5 IU/ml）的定值校准品，将高浓度（H）与低浓度（L）样本按预定比例稀释，稀释后的浓度覆盖试剂说明书给定的线性范围，按5L，4L+H，3L+2H，2L+3H，L+4H，5H 的比例配制成6 个系列浓度样本，以200 µl 为一个单位，每个浓度水平的样本量为1.00 ml，每个样本重复检测3 次，取其平均值。以理论值为横坐标（X），以检测均值为纵坐标（Y），拟合一次曲线Y=a+bX，进行回归分析，求相关系数r2。0.95≤r2≤1.05 被认为线性良好。

1.3.5 生物参考区间验证 选取20 份体检健康者（体检报告诊断无异常者）新鲜血清，其中男10 例，年龄18～89 岁，女10 例，年龄18～88 岁。将20 份标本的检测结果与厂家提供的生物参考区间进行比对，不超过1 例的测定值落在厂家提供的参考区间之外，则验证通过。

1.4 统计学处理

本研究基础数据由Maglumi2000 P 检测系统生成，连续变量符合正态分布的数据采用±s表示。采用Microsoft Office Excel 2016 软件进行统计学分析，计算相关系数、拟合回归方程。

2 结果

2.1 精密度验证结果

Anti-dsDNA IgG 高、低水平的重复性精密度CV＜8%，中间精密度CV＜15%。见表1。均在厂家说明书声称的可接受范围内，表明精密度验证通过。

表1 抗双链DNA IgG 精密度实验

2.2 准确度验证结果

（1）通过3 次实验检测，计算均值得出回收率为94.09%，在90%～110%范围内，表明回收率实验验证通过。见表2。

表2 抗双链DNA IgG 回收实验结果（IU/ml）

（2）通过和国家卫健委室间质评物比对，符合率为100%，表明符合率验证通过。见表3。

表3 抗双链DNA IgG 符合率验证结果（IU/ml）

可见，回收率和符合率均符合厂家提供的标准，表明准确度验证通过。

2.3 检出限验证结果

计算结果显示，检出限结果为0.443 IU/ml，＜0.500 IU/ml表示检出限验证通过。见表4。

表4 抗双链DNA IgG 检出限验证结果（IU/ml）

2.4 线性范围验证结果

高、低浓度校准品混合后的检测均值和理论值见表5，相应的散点图见图1。拟合的一次曲线为Y=0.980X-2.610，相关系数r2=0.998，b=-2.610＜0.970，均在范围内，表示线性良好。

图1 抗双链DNA IgG 线性范围

表5 抗双链DNA IgG 线性范围验证（IU/ml）

2.5 生物参考区间验证结果

20 份体检健康者血清检测结果显示，Anti-dsDNA IgG检测值范围为6.942～15.910 IU/ml，厂家提供的生物参考区间为≤30 IU/ml，表示验证通过。见表6。

表6 抗双链DNA IgG 生物参考区间

3 讨论

随着污染的加重、压力的增加，以及自身抗体检测的普及等，自身免疫病的发病率出现上升趋势［2-3］。SLE 是一种多发于青年女性的器官非特异性自身免疫病，主要侵犯结缔组织并影响多个器官［12-13］。Anti-dsDNA 多见于SLE 患者中，阳性率为40%～90%，特异度超过90%［5,14］。患者体内Anti-dsDNA IgG 的浓度与SLE 的活动度成正比，并且与患者肾脏功能的损伤程度密切相关。由于SLE 的治疗是终生过程，因此准确快速地检测Anti-dsDNA IgG 的浓度对SLE 患者意义重大［7-10］。Anti-dsDNA IgG 是患者治疗监测的重要指标。为提高实验室检测水平，寻求更好、更快的检测方法，本研究对现有的Maglumi2000 P 检测系统定量检测Anti-ds-DNA IgG 的能力进行验证。

目前实验室检测Anti-dsDNA IgG 采用的方法有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、放射免疫法、免疫印迹法、化学发光法、液态芯片技术、蛋白质芯片技术等［15-16］。间接免疫荧光法是检测Anti-dsDNA IgG 的经典方法，采用绿蝇短膜虫为基质进行检测，需要特殊的荧光显微镜观察，工作人员需经过专业培训，并且易受到非特异性荧光干扰，结果不能定量［17］。酶联免疫吸附法一般采用间接法检测Anti-dsDNA IgG 的含量，应用普遍，但该法需要成批检测，耗时较长，影响因素多，操作较复杂［17-18］。放射免疫法是检测Anti-ds-DNA IgG 的金标准，可以实现定量检测，但会产生放射性污染，国内实验室几乎不再将其作为常规方法［18］。免疫印迹法一般半定量，可同时检测多种自身免疫抗体，但价格高，检测时间较长，作为单项Anti-dsDNA IgG 指标的检测手段用于治疗监测不适用［19］。液态芯片技术和蛋白质芯片技术是近几年新兴起的检测方法，价格成本较高，可同时检测多种自身抗体，作为初次检测筛查，比较全面，特异度、敏感度均较高。但是信息质量的稳定性和可重复性较差，操作也比较烦琐，作为SLE 患者的治疗监测不适用［15］。

化学发光法是近十几年发展较快的免疫检测方法，从肿瘤标志物、病毒学检测到心肌损伤标志物、激素类检测，项目涵盖全面。该方法采用目前先进的直接发光检测技术，具有较高的特异度和灵敏度，且操作方便，重复性好，准确度高，线性范围广［20］。Maglumi2000 P 检测系统采用化学发光免疫分析法检测Anti-dsDNA IgG，主要是采用dsDNA 抗原（捕获抗原）包被磁性微球，以及采用异鲁米诺衍生物ABEI 发光剂标记鼠抗人IgG 抗体，均为全自动化的设备操作流程，可为实验室提供便利。然而不同实验室之间，其配置、环境、人员操作等因素存在诸多差异，譬如环境温湿度、实验用水水质、实验人员操作习惯、仪器维护保养频次等，故各个实验室有必要基于自身的检测系统，建立和验证检测方法学参数，评价Maglumi2000 P 检测系统各项性能参数是否符合要求，检测结果是否准确可信。

本实验室的方法学性能评价结果表明，Maglumi2000 P检测系统定量测定Anti-dsDNA IgG 的精密度、准确度、检出限、线性范围和生物参考区间与厂家提供的基本一致，与目前实验室所采用的酶联免疫吸附法检测结果相符，且检测速度更快，同一批号试剂一次定标后无需再校准。检测性能达到实验室和临床要求，且简便易行、稳定性高，可采取单个标本随时检测，不需要成批操作，大大缩短报告等待时间，解决长时间等待结果的问题。该方法为本院SLE 患者的诊断和治疗监测提供很好的依据。