提高酿酒酵母净化重金属污染能力的研究进展

徐佳钰, 崔艳美, 王小利, 王 娟

(北京工业大学 环境与生命学部,北京 100124)

随着世界工业化程度的提高,越来越多的重金属被排放到水体和土壤中,有毒重金属的持久性和不可降解性导致重金属污染逐渐成为当今最重要的环境问题之一[1].传统物理和化学修复方法不仅价格昂贵,而且会产生有毒的副产品,对环境造成二次污染.生物净化因具有低成本、高效率、不产生二次污染等潜在优势逐渐成为被广泛认可的重金属去除方法[2-5].

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一类重要的工业微生物,是常用的生物净化材料之一.活性酿酒酵母在处理重金属污染过程中涉及细胞外生物吸附和细胞内生物积累2个过程,2个过程可能单独发生,也可能同时发生;而非活性酿酒酵母仅涉及生物吸附过程.酿酒酵母具有安全、低成本、易获得、结构简单等优势[6],但酵母细胞的体积小、表面活性位点数量少、对重金属离子耐受性差、金属吸收特异性弱、难分离等问题使酿酒酵母尚不能工业化的应用于重金属离子净化.近年来,针对提高改造酿酒酵母净化重金属污染能力的研究逐步开展.对酿酒酵母用于生物净化的优势、机理进行了综述,并从生物吸附和生物积累2方面对提高改造酿酒酵母净化重金属污染能力的方法及研究进展进行了概述.

1 酿酒酵母与生物净化

1.1 酿酒酵母用于生物净化的原理

图1 生物净化去除重金属原理[8]Fig.1 Principle of Removing Heavy Metals by Biological Purification

生物净化是利用生态系统中的各种生物来控制有毒污染物积累的技术,已经被用于去除废水和土壤中的重金属[7].酿酒酵母是研究较早的重金属离子生物净化材料,应用于处理环境中重金属污染问题,涉及生物吸附和生物积累2个过程,直观的净化重金属机理如图1所示[8].生物吸附是指金属离子与细胞表面,特别是细胞壁组分中的化学基团相互作用,将重金属离子吸附至细胞表面的被动吸收过程,不需要能量代谢,吸附重金属的量取决于细胞表面金属的动力学平衡[8].该机制包括物理吸附、离子交换、表面络合、无机微沉淀等基础方法[9-12],物理化学改性和细胞表面展示技术是最常用的增加酿酒酵母吸附重金属的方法.生物积累是指酵母细胞通过新陈代谢将重金属离子运送到细胞内部进行沉淀和转化的过程,这一过程依赖于活细胞的多种物理、化学、生物机制,涉及细胞内和细胞外2个过程[11].改造酿酒酵母细胞表面金属转运蛋白、增加酿酒酵母细胞对重金属的耐受性可以使酿酒酵母细胞积累更多重金属,如果在增加金属积累的同时控制积累金属的位置和结晶度或许有助于重金属的回收.此外,酿酒酵母菌株的状态、金属溶液的化学性质、吸附温度、吸附时间、重金属离子浓度、菌体浓度都会对酿酒酵母去除重金属离子产生影响[12].

1.2 酿酒酵母用于生物净化的优势

酿酒酵母,通常被称为面包酵母或出芽酵母,细胞为球形或者卵形,直径5～10 μm,是一种以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物[13].酿酒酵母基因组包含1 200万个碱基对,分成16组染色体,是第一个完成完整测序的真核生物[14],也是最成熟的真核生物表达系统.在工业、化工领域,酿酒酵母最初用于生产面包、啤酒和葡萄酒,近几年被应用于可再生燃料、食品配料、药品生产等领域[15-16].在环境应用方面,酿酒酵母是常用的生物净化材料.酿酒酵母应用于生物净化具有以下优势:第一,产量高易培养,使用简单的发酵技术和廉价的生长培养基可以很容易地扩培酵母;第二,易获得,与其他类型的微生物相比,酿酒酵母作为酿酒和发酵工业的副产品更容易大量获取;第三,安全性高,酿酒酵母是非致病性的真核微生物,在酿酒和面包发酵方面的应用历史悠久,已被美国食品药物管理局归类为公认安全(generally recognized as safe,GRAS)产品,酿酒酵母的重组细胞已被构建并用于生产各种生物化学物质;第四,基因序列完整,是分子生物学研究中的模式生物,可通过基因工程进行加工[2,6,17-18].这些优势使酿酒酵母成为重金属污染处理领域的重要研究对象.

2 生物吸附

酿酒酵母细胞对重金属离子的亲和力与细胞表面官能团的类型和数量直接相关[19].物理化学改性和细胞表面展示技术能够增加酿酒酵母细胞表面涉及重金属吸附的表面基团、电荷,从而增加胞外重金属离子吸附.此外,细胞自体纳米材料是一种新兴的增加重金属吸附的技术,具有很好的发展前景.活性酵母细胞和灭活酿酒酵母细胞均具有生物吸附作用,其中灭活酿酒细胞受温度和pH的影响较小且不需要营养供应,易于储存为干燥的生物质,容易从发酵工业中大量获得.结合物理化学改造酿酒酵母的方法具有低成本、易操作等基础优势,使改造酿酒酵母工业化应用于重金属净化具有良好的理论和应用基础.

2.1 物理化学改性

物理或化学方式处理酿酒酵母细胞提高酿酒酵母对重金属吸附能力主要涉及物理吸附和表面络合机制.物理吸附发生在细胞表面上,通常是带电溶质颗粒与吸附剂之间的吸引产生的静电吸附[10].环三磷酸钠(Na3P3O9)可以磷酸化酿酒酵母细胞使其带有强负电荷,从而通过物理吸附从水溶液中回收重金属离子.Na3P3O9处理过的细胞对镉(Cadmium,Cd)、铜(Copper,Cu)、铅(Lead,Pb)和锌(Zinc,Zn)离子的吸附容量达到1.0 mmol/g细胞干重(gram of cell dry weight,gDCW),是目前使用干酵母研究中的最高水平.同时磷酸化酵母细胞可以选择性吸附稀土离子钕(Neodymium,Nd)、镱(Ytterbium,Yb)[20].阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)处理的酿酒酵母能够去除水溶液中铬酸盐阴离子(CrO42-),去除率高达99.5 %,是未修饰细胞的4倍[21].

络合作用是生物质表面金属与配体相互作用从而吸附重金属的过程.细胞表面的氮、氧、硫、磷原子可以作为配体与重金属离子络合使土壤和水中的重金属保留在酿酒酵母细胞壁表面的官能团(羧基、氨基、硫醇、羟基、磷酸盐)上[22].酿酒酵母净化锶(Strontium,Sr)时,细胞表面的羧基或氨基的氢键会断裂,氮或氧可以提供配位电子,这些电子可以与Sr2+络合形成新的配体如: -O-Sr,-N-Sr,-CO-Sr,可降低Sr污染[23].酿酒酵母暴露辐照后,细胞表面配体增多,在Sr压力下能够存活并恢复正常形态的酿酒酵母,能够络合更多的Sr2+[24].乙醇和烧碱预处理的酿酒酵母体系中羧基和氨基浓度更高,容易与Cu2+形成稳定的络合物,增强Cu2+的生物吸附[25].45 ℃热处理灭活酿酒酵母会导致细胞膜完整性丧失,暴露出细胞内更多的金属结合位点,研究显示热处理后的酿酒酵母对镍(Nickel,Ni)和Zn的结合能力是相同条件下活酿酒酵母细胞的17倍和12倍[26].乙二胺四乙酸二酐(ethylenediaminetetraacetic Dianhydride,EDTAD)是一种可生物降解的活性物质,分子中含有2个酸酐基团,一般通过酰化修饰生物质.EDTAD修饰的酿酒酵母中暴露出更多电离形式的羧基,羧基与Pb2+和Cu2+形成络合物被迅速吸收[27].

2.2 细胞表面展示技术

酵母细胞表面展示技术通过将具有良好的金属结合能力的天然肽或模拟肽与瞄定蛋白融合表达,展示在酵母细胞表面,从而改善酵母细胞处理重金属离子的性能[28].抗汞(Mercury resistance,Mer)操纵子系统中的转录调控因子(mercury resistance transcriptional regulator,MerR)对汞(Hydrargyrum,Hg)离子具有高亲和力和选择性.为了提高酿酒酵母对Hg2+的吸附能力,Wei等[29]首次采用基于α-凝集素展示系统在酿酒酵母表面展示MerR,使酵母工程菌不仅表现出更高的Hg耐受性,而且其吸附能力约为原始菌株和对照菌株的3倍.de Oliveira等[30]用编码金属硫蛋白的毛果杨基因(two versions of a populus trichocarpa gene coding for a metallothionein,PtMT2b)的原始序列(PtMT2b′C′)和具有氨基酸取代的突变序列(PtMT2b′Y′)转化酿酒酵母,其中PtMT2b′Y′的生长菌落数比PtMT2b′C′菌株高37 %,能够吸附溶液中约80 %的Cd.携带PtMT2b′Y′的突变酵母在锰(Manganese,Mn)和铁(Ferrum,Fe)缺乏培养基中的生长略高于非转基因酵母,说明该转基因蛋白质可以螯合这些金属.Sreeshma等[31]研究发现蛋白质结构中针对重要污染物Hg和铬(Chromium,Cr)的特定金属结合基序是寡肽,将寡肽展示在大肠杆菌和酿酒酵母等微生物的表面,菌株可以通过生物吸附有效去除天然Hg(Ⅱ)和Cr(Ⅵ).这些研究为酿酒酵母通过表面展示技术吸附重金属离子提供良好的科学依据.

2.3 细胞内自体纳米材料

微生物细胞的细胞膜能够保持细胞内部离子与周围环境平衡,细胞内部不产生任何金属纳米材料.然而,人为打破平衡可以在微生物细胞内产生纳米材料.Ma等[32]将酿酒酵母在麦芽糖溶液中活化,通过呼吸作用产生二氧化碳,然后向培养剂中添加氢氧化钙(Ca(OH)2)的饱和溶液使Ca2+和OH-进入酵母细胞内部.在碱性环境下,酵母细胞内的二氧化碳可以形成CO32-离子,Ca2+离子可以与来自细胞的生物分子如蛋白质和多糖相互作用,最后形成碳酸钙(CaCO3)晶体.收集、洗涤和干燥产物可以得到含有CaCO3纳米颗粒的改造酿酒酵母细胞.纳米修饰酵母细胞对Cd的生物吸附能力是原始酵母细胞的2倍以上,对Pb的生物吸附能力是原始酵母细胞的3倍以上[33].细胞内部的CaCO3可作为储存器,在pH值合适时可转化为PbCO3或CdCO3,从而进一步增强酵母细胞吸附重金属能力[34].含有纳米矿物质的微生物吸附重金属时充分利用了微生物内部晶体结构吸附重金属,使吸附效率大大提高.

3 生物积累

细胞膜转运体、细胞器存储系统和螯合剂分子等几个基本的金属运输组件对酿酒酵母吸收金属离子是必不可少的.增加酿酒酵母对重金属的生物积累涉及增加酿酒酵母细胞对重金属吸收和耐受性.改造或异源表达细胞表面金属转运蛋白能够增加酿酒酵母细胞对重金属的吸收,设计对金属转运特异性的酿酒酵母,这将对矿区、油田等地区的特定重金属污染有重要的意义.生物细胞内重金属的抗性系统包括排斥、区室化、合成复合物或结合蛋白[35],促进重金属离子区室化、增加金属螯合和过表达金属抗性的相关基因能够增强酵母细胞对重金属的耐受性.此外,在增加胞内金属积累过程中,如果能够控制重金属积累位置和结晶度,将有利于重金属的回收和再利用.

3.1 酿酒酵母对重金属的吸收

3.1.1 改造金属转运蛋白

改造酿酒酵母重金属转运蛋白的表达水平能够提高酿酒酵母对重金属离子的摄取.Luk等[36]和Sun等[37]在酵母中用酵母半乳糖激酶(galactose metabolism,GAL1)启动子过表达转运Zn,Cu,Fe,Mn金属离子的一组膜金属转运蛋白.研究发现过表达锌转运蛋白(Zinc-regulated transporter,Zrt)Zrt1,Zrt2和铜转运蛋白(Copper transport,Ctr)Ctr1,Ctr3能够使酿酒酵母对Zn和Cu的摄取量增加10倍[36];过表达铁转运蛋白(low-affinity Fe(Ⅱ) transport protein,Fet4)和锰转运蛋白(Manganese transporter,Smf1)能够使酿酒酵母对Zn,Cu,Fe,Mn的摄取量增加3～5倍[37].细胞中砷(Arsenic,As)和Cr通常以含氧盐的状态存在,如砷酸盐、铬酸盐.由于磷酸盐和砷酸盐、硫酸盐和铬酸盐具有空间相似性[38],过表达磷酸盐通透酶(inorganic phosphate transporter,Pho)Pho84,Pho87,Pho89和硫酸盐通透酶(sulfate permease,Sul)Sul1,Sul2能够分别使砷酸盐吸收增加3～5倍、铬酸盐吸收增加10倍以上.改造金属转运蛋白增强金属吸收,需要注意增加蛋白质产量和提升蛋白质存在的稳定性以延长其表达寿命,同时应限制酿酒酵母因过量摄取重金属离子导而致细胞功能受损.将SMF1的泛素化位点K33,34突变为精氨酸有助于减少Smf1蛋白降解,同时敲除泛素连接酶(bypass SOD defects protein 2,BSD2)可提高Smf1在细胞内的稳定性.通过甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)启动子进行整合,进一步提高对Cd和Mn的吸收[37].

3.1.2 异源表达金属转运蛋白

研究发现在酵母细胞中异源表达水稻中对铝(Aluminium,Al)具有选择性吸收的植物天然抗性相关巨噬细胞蛋白(natural resistance-associated macrophage protein,Nramp)家族铝转运蛋白(NRAMP aluminum transport,Nrat1),与野生型相比,对Al的吸收增加了5倍以上,但是对Fe2+,Mn2+,Cd2+等二价金属的吸收没有明显变化[39].因此,将其他物种中细胞表面金属转运蛋白在酿酒酵母细胞异源表达可以有效增加金属离子的吸收.

3.1.3 设计吸收特异性金属的酿酒酵母

采矿、纺织、石油行业会涉及特定金属产生的污染,获得对特定金属吸附效率高的酵母细胞对解决环境重金属污染具有重要意义.已有研究报道通过改造酿酒酵母膜蛋白,可以设计出转运特定金属的酿酒酵母.NRAMP在维持细胞内金属稳态和应对环境重金属压力方面发挥着重要作用[40],NRAMP家族中的跨膜结构域(transmembrane domains,TM)TM1,TM4和TM6参与金属选择性吸收和转运.同源分析发现酿酒酵母中SMF1与耐辐射奇球菌(Deinococcusradiodurans)和头状葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)中NRAMP家族蛋白具有同源性.Sun等[37]结合NRAMP点突变的晶体学和已有研究的信息,对SMF1跨膜结构域进行设计改造构建突变体库,经过高通量筛选、测序分析并验证确定有效突变位点后获得SMF1突变体,该突变体可以特异性的转运Cd和Sr,但对Mn的吸收降低10倍以上.这一研究为设计酿酒酵母特异性回收环境污染中的重金属提供了新思路.

3.2 酿酒酵母的重金属耐受性

3.2.1 促进金属离子区室化

研究发现过表达液泡铁转运蛋白(cross-complementer of CSG1 protein,Ccc1)和金属阳离子转运体(cobalt uptake protein,Cot1)等能够增加Cd2+在酿酒酵母的液泡储存.过表达液泡转运蛋白和改造酿酒酵母细胞表面金属转运蛋白能够在增加重金属离子吸收时具有叠加作用[37].因此,可以同时设计优化细胞表面和细胞器重金属离子转运蛋白,增加重金属在酵母细胞内区室化和细胞的重金属吸收量,降低重金属对细胞的毒性影响,增强细胞的耐受性.

3.2.2 增加金属螯合

谷胱甘肽、金属硫蛋白和植物螯合素等金属螯合剂能够结合金属,将重金属离子从敏感的代谢功能中移除.设计酿酒酵母增加金属螯合,能够使酿酒酵母吸收更多的金属离子.在发酵条件下,酿酒酵母硫酸盐同化途径会产生硫化氢(H2S),通过中断酿酒酵母产生的硫化物的进一步转化可以用于诱导金属硫化物沉淀.研究发现敲除硫酸盐同化途径的天冬氨酸-半醛脱氢酶(aspartate-semialdehyde dehydrogenase,HOM2)、O-乙酰丝氨酸/O-乙酰高丝氨酸巯解酶(bifunctional cysteine synthase/O-acetylhomoserine aminocarboxypropyltransferase,MET17)和胱硫醚β合成酶(Cystathionine beta-synthase,CYS4)会迫使中间产物H2S排出,抑制硫化物向半胱氨酸和蛋氨酸等含有硫醇的生物分子的正常转化,使得Cu,Cd,Hg和Pb的吸收量接近对照组的2倍[41].人类金属硫蛋白2A(metallothionein 2A,MT2A),也称MT2,是人类金属硫蛋白家族的主要亚型.Geva等[42]通过诱导型CUP1启动子(CUP1 promoter,pCUP1)异源表达人类金属硫蛋白基因hMT2,产生改造的酿酒酵母菌株,能够去除细胞中过多的Cu2+.来自小麦的植物螯合肽合成酶1(phytochelatin synthase 1,TaPCS1)通过GAP启动子整合到酿酒酵母基因组进行蛋白表达,使Cd耐受性达到对照组的10倍,Cu,Zn,Mn和钴(Cobalt,Co)的耐受性提高2～10倍[37].

3.2.3 筛选金属耐受性相关基因

增加酿酒酵母对重金属离子的耐受性的基因主要涉及谷胱甘肽代谢过程基因调控、缓解氧化应激相关的基因或蛋白、将重金属从胞内运出或封闭在液泡内的转运蛋白以及结合重金属降低细胞毒性的金属硫蛋白和植物螯合肽.表1列出了几种典型的金属耐受性相关基因及其功能.此外,筛选其他金属耐受性相关的基因也能有效提高酵母细胞对重金属耐受性.研究发现在重金属压力下,酿酒酵母中诱导减数分裂相关调节因子(signal transduction response regulator of IME2,RIM15)损伤会导致细胞对重金属的耐受性增加[43].Chen等[44]对酿酒酵母工业菌株CEN.PK2-1c进行了基因组规模的过表达筛选,得到已知能够提高镉耐受性的镉抗性基因(cadmium resistance,CAD1)和CUP1,以及研究较少的镉抗性抑制子(copper-resistant suppressor,CRS5)、葡萄糖抑制基因负调控因子(negative regulator of glucose-repressed genes,NRG1)、蛋白质磷酸酶(protein phosphatase,PPH21)、14-3-3家族蛋白1(14-3-3 family protein 1,BMH1)和泛素醇-细胞色素c还原酶亚基(ubiquinol-cytochrome-c reductase subunit,QCR6),将筛选得到的Cd抗性相关的基因构建PRS416质粒并在酵母细胞中过表达,Cd的添加激活了CAD1,CRS5,CUP1和NRG1基因转录,将这4个基因进行两两组合优化,结果显示CAD1和NRG1共表达时酵母细胞Cd耐受性最高,为进一步提高酵母抗Cd能力提供新途径.

表1 酿酒酵母中典型金属耐受性相关基因Tab.1 Metal Tolerance-related Typical Genes in Saccharomyces cerevisiae

3.3 酿酒酵母与重金属回收

解吸剂解吸、焚烧等方式可以实现酿酒酵母和重金属的分离.理论上通过合适的生物质解吸剂可以使吸附重金属的酿酒酵母细胞再生并回收有价值的重金属,但是针对不同的吸附条件,需要通过大量的实验进行解吸剂的筛选,已有研究中采用的无机酸、有机酸、螯合剂等解吸剂的解析率可以达到85 %,但是这些方法的实用性低,会对酿酒酵母造成损伤,不适用于积累在酿酒酵母细胞内的重金属回收.考虑到酿酒酵母价格比较便宜,结合重金属后的酿酒酵母也可以直接采用强酸、高温等方式处理.研究显示550 ℃焚烧酿酒酵母与金属的结合体4 h后,酿酒酵母的量减少98 %,燃烧后的灰烬可以通过微波辅助过程进行酸消化,得到的金属溶液浓度是未处理时的170倍,最后将所得溶液进行碱性沉淀获得高产率、高纯度的金属,得到的重金属可以重复利用[51-52].

在化学沉淀中容易形成难以分离的大块无规则形状的物质,通常被倾倒在垃圾场填埋或焚烧[53-54].因此,控制沉淀物的形态和结晶度将有助于金属离子分离.研究发现较慢的硫化氢产生速率有助于金属扩散并成核到酵母细胞表面上,但此时这些沉淀是无序的非晶体结构.Sun等[41]敲除将硫化物转化为氨基酸的基因使硫化物的产生速度减慢,并在酵母细胞中展示生物矿化肽促进金属成核,使非晶体结构的沉淀转化为更利于提取的硫化镉点状纳米颗粒.其中金属成核技术已经成功应用于病毒细菌等生物有机体,通过成核肽促进金属硫化物的生长,有利于金属硫化物的萃取和回收[55].今后的研究中如果能够控制沉淀物的大小和结晶度,开发通过细胞壁直接进行金属提取的方法,将会简化金属的回收,促进资源重复利用,为发展绿色生态提供新途径.

4 结论与展望

上世纪90年代,生物学家开始开展用特定生物去除重金属离子的研究.但是目前,生物净化技术仍难以商业化.与传统的物理、化学方式处理重金属离子的方法相比,生物净化虽然吸收重金属的量有限,但是具有成本低、易获得、不产生二次污染等优势.酿酒酵母安全、经济实惠、容易大量培养,已应用在各种有益的工业中,如被改造用于青蒿素、丁二酸、乳酸等的大规模生产,改造酿酒酵母提高其生物净化效率的研究也一直在进行.

从增加酿酒酵母对重金属的生物吸附和生物积累2个角度总结了改造酿酒酵母提高其生物净化效率的方法.关于生物吸附,可以采用简单的物理化学方法改造酿酒酵母,暴露重金属吸附的表面基团、电荷.目前,全球发酵行业每年使用300万吨酵母,酵母市场预计在未来5年将增长35 %,结合酿酒酵母的可降解性,发酵工业中残留或剩余的酵母可以作为低价值资源大规模应用于去除水中的微量污染物,也可以减少资源浪费;生物积累角度,如果能够通过改造酿酒酵母实现重金属的大量摄取或贵重金属的特异性回收,同样存在重大的经济效益.由于处理实际污染的复杂性,应用生物净化处理重金属污染仍然存在挑战.开发高吸附力、高抗性、吸收特异性金属的酿酒酵母工业菌株有待于进一步研究.基于以上方法,如果将改造酿酒酵母提高其生物净化能力的多种方法进行总结、融合或许是一个有前景的研究方向.

酿酒酵母在处理重金属污染领域还处于实验和中试阶段,实验中采用的离心、过滤的方法分离酿酒酵母与重金属结合物的方式成本较高,不适用于工业化的应用.开发无毒、传质性能好、性能稳定的酿酒酵母固定载体在今后的研究中或许能有效的实现酿酒酵母的回收利用.酿酒酵母大规模用于生物净化,特别是重金属的沉淀和转化,将对重金属废物的回收和再利用产生深远的影响.