炎症癌相关成纤维细胞介导结直肠癌细胞耐药的机制研究

蔡家洛，朱锐秋，李 森，曹亦军，黄 坊

1. 上海中医药大学附属普陀医院普外科，上海 200062；

2. 华东理工大学药学院，上海 200237；

3. 安徽医科大学上海普陀中心临床学院，上海 200062；

4. 上海中医药大学附属普陀医院病理科，上海 200062

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤［1］。尽管针对癌症进展的新药不断涌现，但耐药性问题仍然是该领域的一个挑战［2］。近年来，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）在化疗耐药中的重要性已广受关注［3］。癌相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast，CAF）是TME的主要组成成分，其分泌的细胞因子、趋化因子等参与肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移和耐药过程。CAF具有异质性，分为肌成纤维CAF（myofibroblastic CAF，myCAF）、炎症CAF（inflammatory CAF，iCAF）和抗原提呈CAF（antigenpresenting CAF，apCAF）［4］。CAF因其独特的细胞状态和多种机制介导的促肿瘤功能，成为分析TME在化疗耐药中作用的重要靶点［5］。iCAF作为CAF的炎症亚型，通过产生细胞因子等物质参与肿瘤的耐药过程［6］。然而，iCAF对CRC耐药的影响还有待确定。本研究以iCAF无血清培养刺激iCAF分泌炎症因子以获得条件培养基，再以iCAF条件培养基（iCAF-conditioned medium，iCAF-CM）刺激CRC细胞，探讨iCAF与CRC细胞耐药的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

人结肠癌RKO细胞、HCT116细胞购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库，人肠成纤维细胞（human intestinal fibroblast，HIF）购自美国ScienCell研究实验室，CRC组织来源的CAF从CRC患者（于2022年8月-2022年9月在上海中医药大学附属普陀医院经手术切除）的癌组织中分离得到。细胞培养条件是37 ℃、CO2体积分数为5%。组织标本的使用均征得患者的知情许可。本研究获得上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会批准［伦理批件编号：PTEC-A-2023-5（S）-1］。

1.1.2 试剂

DMEM培养基、RPMI-1640培养基、双抗、胰酶均购自美国Gibco公司，上样缓冲液、RIPA裂解液均购自美国CST公司，细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自日本同仁化学研究所；Annexin Ⅴ-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，TritonX-100、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulphate，SDS）、免疫染色固定液、细胞核蛋白抽提试剂盒均购自上海Beyotime公司，实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）试剂盒购自美国EZBioscience公司。

1.1.3 仪器

酶标仪、PCR仪均购自美国Thermo Fisher公司，凝胶电泳仪购自美国Bio-Rad公司，共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司，CytoFLEX流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

分别用RPMI-1640和DMEM培养基［加入100 U/L青霉素+链霉素，10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）］对冻存的HCT116、RKO和HIF细胞进行复苏，以1h105个/cm2进行培养，置于细胞培养箱中（37 ℃、CO2体积分数为5%）。待细胞数量长至对数期时，进行传 代。

1.2.2 提取原代CAF

取患者新鲜CRC组织标本，采用组织块培养法分离培养CAF。

1.2.3 免疫荧光

CAF（2h104）在显微镜玻片上接种培养过夜。用PBS洗涤2次，甲醇固定15 min，0.2% TritonX-100渗透5 min，在室温下使用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭1 h后，4 ℃下一抗［FAP（1∶100稀释，兔源）、血小板源性生长因子受体α（platelet derived growth factor receptor alpha，PDGFRA）（1∶500稀释，兔源）］温育过夜，然后与二抗［山羊抗小鼠IgGH&L（AlexaFluor®488）］和［山羊抗兔IgGH&L（AlexaFluor®594）］温育2 h。用DAPI进行核定位评估。

1.2.4 筛选iCAF并获得iCAF-CM

从参考文献［7］可知，PDGFRA是iCAF的标志物，因此本研究使用PDGFRA作为筛选iCAF的标志物，通过免疫荧光，从CAF中筛选出高表达PDGFRA的CAF，即为iCAF。

1.2.5 获得条件培养基

单独培养HIF和iCAF，当细胞生长至80%时，将培养基更换为不含FBS的培养基。处理48 h后，收集细胞悬液作为条件培养基。高速离心后收集条件培养基，用0.22 μm微孔膜过滤，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.6 实验分组

将肿瘤细胞分为对照组（仅加入培养基）、实验组1［加入HIF条件培养基（HIF-conditioned medium，HIF-CM）］和实验组2（加入iCAFCM）。每组均设置HCT116和RKO两种肿瘤细胞。

1.2.7 CCK-8法检测肿瘤细胞存活率

以2h104个/孔分别接种HCT116和RKO细胞到96孔板中培养24 h，随后分别使用奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）和5-FU药物作用24 h，以每孔100 μL CCK-8溶液加入孔中，培养温育30 min，于450 nm波长处检测吸光度（D）值。实验重复3次，取平均值。

1.2.8 流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率

选择各组中对照组的1/2半数抑制浓度（half inhibition concentration，IC50）作为诱导凋亡的药物浓度，给药24 h后，使用Annexin Ⅴ/PI双染法检测细胞凋亡，根据两种染料不同的激发波长，分别使用流式细胞仪所带的异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和PE通道对样品进行检验。

1.2.9 蛋白质印迹法（Western blot）检测caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin蛋白水平

分别用HIF-CM和iCAF-CM对肿瘤细胞进行刺激。48 h后，用对照组IC50浓度的OXA和5-FU分别对肿瘤细胞进行处理。24 h后，PBS冲洗且在冰上裂解后，4 ℃超速离心，提取上清液，定量。随后沸水中煮5 min，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝胶分离，转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在5%脱脂奶粉中封闭1.5 h后加入一抗鼠抗β-actin（1∶5 000）、兔抗caspase-3（1∶1 000）、鼠抗Bcl-2（1∶1 000）、兔抗Bcl-xL（1∶1 000）、兔抗survivin（1∶500）于4 ℃摇床温育过夜，用含有吐温-20三乙醇胺缓冲盐溶液（tris-buffered saline Tween，TBST）漂洗后，加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（1∶20 000）和山羊抗兔IgG（1∶20 000）室温温育1 h，随后用TBST漂洗，采用电化学发光（electrochemical luminescence，ECL）法，在凝胶成像系统中曝光检测，用Image J 软件对Western blot结果进行定量分析。

1.2.10 用RTFQ-PCR法检测caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的mRNA表达水平

裂解液裂解细胞后，使用RNA快速提取试剂盒提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，随后用RTFQ-PCR检测caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的mRNA表达，扩增条件为：95 ℃预变性5 min进入循环，95 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，72 ℃延伸5 min，以β-actin为内参基因。用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达量，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。引物设计时，β-actin的上游引物序列为5'-CCC AGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3'，下游引物序列为5'-ATCTGCTGGAAGGTGGACAG CGA-3'；Caspase-3的上游引物序列为5'-CCAAAGATCATACATGGAAGCG-3'，下游引物序列为5'-CTGAATGTTTCCCTGAGGTTTG-3'；Bcl-2的上游引物序列为5'-GACTTCGCCGAGATG TCCAG-3'，下游引物序列为5'-GAACT CAAAGAAGGCCACAATC-3'；Bcl-xL的上游引物序列为5'-GCATATCAGAGCTTT GAACAGG-3'，下游引物序列为5'-GAAGGAGAAAAAGGC CACAATG-3'；Survivin的上游引物序列为5'-CCGCATCTCTACATTCAAGAAC-3'，下游引物序列为5'-CTCCTTGAAGCAGAAGAAACAC-3'。

1.2.11 通过Western blot探究iCAF对Wnt/β-catenin信号转导通路的影响

采用条件培养基和对照组IC50浓度的OXA和5-FU处理细胞，使用细胞核蛋白抽提试剂盒提取核内蛋白。采用Western blot检测肿瘤细胞总蛋白的表达水平以及细胞核中β-catenin和Lamin B1蛋白的表达水平。

1.3 统计学处理

数据用GraphPad Prism 7和SPSS 25.0软件进行统计分析。实验结果用表示，用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey’s multiple comparisons test进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 原代CAF提取及亚型鉴定

首先使用CRC组织标本提取原代CAF，对细胞株命名为CAF-71和CAF-95。镜下观察其形态呈长梭形（图1）。提取的原代细胞表达CAF常见表面标志物FAP和PDGFRA，表明提取的原代细胞是成纤维细胞，其中CAF-95对PDGFRA高表达，为iCAF，因此选用CAF-95细胞进行培养并获得条件培养基（95-CM），以便后续实验的进行。

图1 原代CAF验证及筛选Fig. 1 Primary CAF verification and screening

2.2 CRC细胞的IC50升高

随着OXA和5-FU药物浓度的上升，HCT116和RKO细胞的存活率不断下降。结果显示，HCT116细胞中，对照组OXA的IC50为10.701 4 μmol/L，HIF-CM组OXA的IC50为12.972 2 μmol/L，95-CM组OXA的IC50为30.380 4 μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.000 1）；RKO细胞中，对照组OXA的IC50为29.785 5 μmol/L，HIF-CM组OXA的IC50为32.536 8 μmol/L，95-CM组OXA的IC50为55.690 8 μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.000 1）。HCT116细胞中，对照组5-FU的IC50为87.531 2 μmol/L，HIF-CM组5-FU的IC50为86.861 9 μmol/L，95-CM组5-FU的IC50为135.781 0 μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.01）；RKO细胞中，对照组5-FU的IC50为18.235 5 μmol/L，HIF-CM组5-FU的IC50为21.732 0 μmol/L，95-CM组5-FU的IC50为36.817 9 μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.001，图2）。95-CM培养后，HCT116和RKO细胞对OXA和5-FU的IC50明显升高，存活率升高，说明经iCAF刺激后，CRC细胞可能产生了耐药。

图2 CCK-8检测加入95-CM前后肿瘤细胞的存活率变化Fig. 2 Cell viability of tumor cells treated with or without 95-CM tested by CCK-8

2.3 iCAF抑制CRC细胞凋亡

两种癌细胞在两种抗肿瘤药物的分别作用下，相较于对照组和HIF-CM组，95-CM组中的细胞凋亡水平明显下 降（图3）。

图3 流式细胞术检测加入95-CM前后肿瘤细胞的凋亡水平变化Fig. 3 Apoptosis rate of tumor cells treated with or without 95-CM tested by flow cytometry

为验证以上结果，我们进一步检测了iCAF刺激的肿瘤细胞中凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的表达水平变化（图4）。与对照组和HIF-CM组相比，95-CM组中，凋亡蛋白caspase-3的表达水平明显下降，而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL和survivin的表达水平均有所上升（P＜0.05）。采用RTFQPCR检测了以上几种蛋白的mRNA水平，所得结果与Western blot一致，差异有统计学意义（P＜0.05，图5）。上述结果说明经iCAF刺激后，肿瘤细胞的凋亡减少，也就证明iCAF能够介导CRC细胞耐药。

图4 Western blot检测β-actin、caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的表达Fig. 4 The expressions of β-actin, caspase-3, Bcl-2, Bcl-xL and survivin tested by Western blot

图5 RTFQ-PCR检测caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL和survivin的mRNA水平Fig. 5 The mRNA expressions of caspase-3, Bcl-2, Bcl-xL and survivin tested by RTFQ-PCR

2.4 iCAF激活Wnt/β-catenin信号转导通路

本研究进一步探索了Wnt/β-catenin信号转导通路的变化。结果显示，3组的肿瘤细胞内β-catenin蛋白的表达水平相比较，总蛋白未见明显差异，核内蛋白表达产生明显差异（P＜0.05，图6）。从图中可以看出，95-CM组中，β-catenin发生转移，在β-catenin总蛋白不变的情况下，细胞核中的β-catenin增多，说明经iCAF刺激后，Wnt/β-catenin信号转导通路被激活，从而导致CRC细胞耐药的产生。

图6 经95-CM刺激后CRC细胞内Wnt/β-catenin信号转导通路的表达变化Fig. 6 Changes of Wnt/β-catenin signalling pathway in CRC cells stimulated by 95-CM

3 讨 论

CRC发病率在恶性肿瘤中重高居第3位，病死率高居第2位［8］。

近年来，TME在肿瘤耐药中的作用逐渐引起人们注意并被广泛研究［9］。其中，CAF是TME的重要组成部分，在肿瘤耐药中发挥重要作用［10］。CAF可以通过多种途径介导肿瘤细胞耐药［11］：① 抑制肿瘤细胞凋亡；② 重塑细胞外基质；③ 促进肿瘤细胞上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）；④ 驱动免疫抑制；⑤ 增强肿瘤代谢；⑥ 调控肿瘤干细胞。

本研究通过免疫荧光，从原代CAF中筛选出iCAF即CAF-95后，使用95-CM刺激CRC细胞，运用CCK-8法检测到经刺激后，CRC细胞对抗癌药物OXA作用的存活率上升。本研究进一步发现，经CAF-95刺激后，凋亡蛋白caspase-3及其mRNA的水平明显下降，抗凋亡蛋白Bcl-2、BclxL和survivin及其mRNA的水平均有所上升，证实iCAF能够促进CRC耐药。

Wnt/β-catenin信号转导通路对肿瘤细胞的凋亡有一定作用，同时也参与EMT的过程。有研究［12］发现，CAF激活Wnt/β-catenin信号转导通路，通过抑制细胞凋亡调节剂1和含F框WD重复域蛋白7进而抑制线粒体凋亡，增强CRC细胞对抗癌药5-FU的耐药性。另外有研究［13］发现，与对照组相比，CAF上清液培养的卵巢癌细胞E-钙黏蛋白的表达水平更低，且CAF分泌的CXCL12可以激活肿瘤细胞中的CXCR4/Wnt/β-catenin信号转导通路诱导EMT，导致顺铂抗性增强。

Wnt/β-catenin信号转导通路在多种肿瘤中都被高度激活，有许多对癌症具有潜在治疗效果的Wnt信号转导通路抑制剂药物的研究正在进行［14］。有研究［15］显示，Wnt/β-catenin信号转导通路在CRC间质的CAF中高表达。因此我们推测iCAF介导CRC细胞耐药可能与Wnt/β-catenin信号转导通路有关。本研究通过Western blot对95-CM刺激下的CRC细胞内β-catenin表达进行检测，观察到细胞质中β-catenin减少，进入细胞核增加，Wnt/β-catenin信号转导通路被激活，参与了耐药过程。

本研究仍存在一定局限性。首先，CAF具有异质性，不同表型具有不同的功能，本研究仅研究iCAF对CRC耐药的影响，但CAF的其他表型（如myCAF）是否也具备同样的功能及可能存在的机制尚不清楚。其次，本研究证明了iCAF通过激活Wnt/β-catenin信号转导通路促进一系列凋亡蛋白的变化，从而介导CRC耐药，研究还不够深入，具体机制仍有待探索。之后的研究可将重点放在Wnt/β-catenin信号转导通路如何参与耐药过程，如发现可能的结合位点和转运蛋白上。另外，Wnt信号转导通路与癌症发生密切相关，但既往研究［14］表明，阻断Wnt信号往往会伴随着不良反应的发生，如破坏组织稳态和再生等。

综上所属， iCAF可能是通过Wnt/β-catenin信号转导通路抑制肿瘤细胞的凋亡，并促进肿瘤细胞的EMT过程，进而诱导CRC细胞耐药。因此未来可以将iCAF视作设计抗癌药物的潜在靶点。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。