斑马鱼肝细胞癌模型研究的最新进展

屈芷馨李宪美张峰华*

（1. 福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室，福州 350122；2. 福建中医药大学中西医结合研究院福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福州 350122）

据世界卫生组织统计，肝癌已成为威胁人类健康的第六大癌症类型，其死亡率高居第二［1］。 随着世界人口的不断增长，人类对环境的破坏日益严重，肝癌的发病率及死亡率仍在持续上升。 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种原发性肝癌，占所有肝癌病例的90% ～95%［2］。 由于病人早期不会表现出明显症状，极少主动就诊，往往晚期才被确诊，但已错失最佳治疗时期。 早期诊断的肝癌肿瘤标志物包括甲胎蛋白、凝血酶原等，但二者的升高也不排除是由妊娠、肝炎、肝硬化等原因导致的，这给HCC 的早期诊断带来了一定的挑战。

目前，针对HCC 患者的治疗手段比较有限，且存在一定的局限性。 一般认为手术切除、肝移植以及局部消融等方式对于早期HCC 患者具有一定的临床治疗潜力。 然而，手术切除可能无法清除所有的肝癌细胞，肝移植也会受到供体肝数量的限制。对于直径较小或位于肝深部的肝癌组织，局部射频消融技术比较常用，该技术可在超声或CT 引导下通过电极传递电磁能量，最终导致肿瘤热坏死，但该技术对于组织较大或邻近血管的肿瘤并不适用。中晚期肝癌患者一般需要通过放射性治疗或化学药物治疗来维持一定的生活质量并提高生存率，但这也仅仅是一种非治愈性疗法，且常伴有严重的副作用，同时还存在耐药性问题。 临床上，有4 种较新的肝细胞癌化疗药物，包括一线药物乐伐替尼，二线药物瑞戈菲尼、雷莫芦单抗及卡博替尼。 但不同患者对药物的敏感性不一，因此建立合适的人源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型用于评估不同患者的药物敏感性对于指导HCC患者的临床用药十分必要。

不论是新技术手段还是新药开发，均需要利用动物模型来验证其有效性或测试其毒副作用。 通常，利用小鼠模型可以获得致癌基因诱导细胞恶性转化的分子机制，并揭示肿瘤微环境下癌细胞的动力学变化及对药物的治疗响应情况。 但小鼠模型不可避免地会存在以下缺点和不足，如饲养成本高、可用于实验的动物数量有限、活体实时成像较为困难、不适合高通量筛选等。 斑马鱼因其独特的优势，可以克服小鼠模型的不足，现已成为生物医药研究领域不可或缺的一种模式生物，其在胚胎发育、毒理学、肿瘤生物学、遗传育种以及药物筛选等领域发挥着重要作用。 本文综述了近年来利用斑马鱼模型进行肝细胞癌相关研究的最新成果，为肝癌研究提供参考。

1 斑马鱼用于构建肝细胞癌模型的独特优势

斑马鱼（Danio rerio）是一种小型热带淡水鱼，迄今为止已被用于构建各种人类疾病模型，包括心血管系统疾病、免疫系统疾病、神经系统疾病、消化系统疾病以及包括肝细胞癌在内的各种癌症模型。相对于其他模式动物而言，其被广泛应用于肝细胞癌模型研究的主要原因包括以下3 个方面。

首先，斑马鱼的肝发育过程、组织结构及功能与人类高度相似。 斑马鱼的肝发生过程主要包括3 个阶段：肝母细胞特化、出芽／分化以及肝生长［3］。在结构上可形成与人类肝相似的左右肝叶及肝内胆管。 在功能上同样发挥调节必需营养素的消化和代谢、维生素的储存、红细胞的分解、血浆蛋白（如凝血酶原、纤维蛋白原等）的合成、白蛋白及荷尔蒙的产生，以及解毒等作用。

其次，调控斑马鱼肝发育及肿瘤发生的关键基因及信号通路是保守的。 如FGF、BMP 和WNT 等信号通路均在斑马鱼肝发生中起关键作用［4－5］。 而人HCC 的致癌基因如KRAS、MYC、UHRF1 等同样能够诱导斑马鱼HCC 的发生［6－8］。 与人类高度相似的遗传背景及组织器官发育模式，使得斑马鱼逐渐成为能够模拟包括HCC 在内的各种人类疾病的良好模式生物。

最后，斑马鱼超强的繁殖能力、小巧的体积、快速的发育过程、低廉的养殖成本等均是其能够快速成为“科研新星”的重要原因。 而且，研究者已开发出无色素的全透明Casper品系［9］，利用该品系可以活体全程追踪内源或外源基因表达变化，以及肿瘤细胞在体内的增殖、迁移情况，这是哺乳类模式动物无法比拟的优势。 此外，斑马鱼学界已在Casper背景下开发出多种免疫缺陷突变体［10－11］，这使得利用斑马鱼成鱼进行肿瘤细胞移植，甚至构建PDX 模型用于肿瘤精准治疗成为可能。

综上所述，利用斑马鱼构建HCC 遗传模型或者异种移植模型优势非常明显，如实验成本低、周期短、便于活体观察、适用于高通量药物筛选等。 基于这些优点，国内外已有大量关于斑马鱼肝细胞癌模型研究的相关成果。

2 斑马鱼的遗传学肝细胞癌模型

近年来，通过全基因组或者全外显子组测序，可以鉴定出HCC 患者体内与肿瘤形成可能相关的遗传变异［12］，对这些变异进行深入的功能研究将有助于揭示新的驱动HCC 发生发展的基因突变，这是实现HCC 个性化治疗的重要前提。

起初，研究者通过已知的化学致癌物，如7，12-二甲基苯并蒽（DMBA）来诱导斑马鱼HCC 的形成［13］。 但这种方法建模周期长、个体差异大，不利于进行相关机制的深入研究。 于是研究者们开始利用遗传学方法来建立斑马鱼HCC 模型，从而模拟人类HCC 中的突变［14］。

2.1 斑马鱼突变体相关的肝细胞癌模型

斑马鱼HCC 的形成过程与人类相似，都要经过肝炎、脂肪变性、纤维化、畸形增生、癌变等步骤。2005 年，Sadler 等［14］通过遗传筛选的手段从297 个斑马鱼突变体中筛选到了7 个突变体，其在发育至5 d 时肝明显增大。 其中，vps18 突变体会出现肝肿大、空泡化，并伴有溶酶体缺失；肿瘤抑制基因nf2的突变体会出现胆总管囊肿；fgr突变体会出现肝细胞增大、脂肪变性。 这些突变体均可作为良好的肝疾病模型或者潜在的HCC 模型。

TP53 是调控细胞增殖与凋亡的关键转录因子，其功能缺失与多种癌症相关，而肝特异性缺失TP53会导致人HCC 的形成［15－17］。 斑马鱼中，tp53 突变体虽然不会自发发生HCC，但其在继发性损伤存在时更易发展为HCC［18］。 乙肝病毒X 抗原（HBx）与HCC 的发生密切相关，Lu 等［19］发现在野生型斑马肝中特异性过表达HBx 会导致脂肪变性、纤维化及糖原积累。 值得注意的是，如果在tp53 突变体中过表达HBx 却能够诱导HCC 的发生，且该过程与src酪氨酸激酶通路的激活有关。 与该机制相一致的是，在tp53 基因突变的背景下过表达src也会导致肝畸形增生、HCC 以及肉瘤样HCC。 2021 年，Luo等［20］利用CRISPR／Cas9 技术在斑马鱼肝中特异性敲除了tp53 和pten，同样证实了tp53 单一突变无法诱导HCC，而pten的缺失足以触发HCC。 值得注意的是，与单突变的斑马鱼相比，pten和tp53 双突变的斑马鱼HCC 发生率及组织学分级更高、且生存期更短。 该研究表明，虽然tp53 突变并非斑马鱼HCC的起始因子，但其突变使得斑马鱼对HCC 致病因子更为敏感，在HCC 的进一步发展过程中扮演着至关重要的角色。

Wnt／β-catenin 信号通路的异常激活与HCC 的发生有关，肿瘤抑制因子APC 的功能缺失会持续性激活Wnt／β-catenin 信号通路［21－22］。 小鼠肝特异性剔除Apc基因会导致Wnt／β-catenin 通路异常激活，从而发生HCC［23］。 斑马鱼中其同源基因apc的杂合突变体会出现自发性肝腺瘤。 若利用DMBA 处理apc杂合突变体，其HCC 的发生率将从20.5%提高至70.8%［24］。 这些结果表明apc突变在触发斑马鱼HCC 过程中发挥着重要作用，与小鼠和人中的基因功能保守性较强。

因此，对于不同HCC 患者，若临床上筛查到新的可能导致HCC 的致癌突变，可利用斑马鱼进行同源基因敲除，制备相应突变体，从而快速验证其是否与HCC 的发生发展有关。

2.2 持续表达型转基因斑马鱼肝细胞癌模型

除了构建基因功能缺失的突变体，研究者们还建立了多种转基因斑马鱼HCC 模型，用于研究特定基因过表达对HCC 发生发展的影响，研究者们大多通过转入突变型致癌基因来建立HCC 模型［6，25-27］。

Ras原癌基因是参与癌细胞内信号转导的核心调节因子，在多种类型的癌症中会发生突变［28－30］。Nguyen 等［6］构建了肝稳定过表达致癌基因krasV12的转基因斑马鱼HCC 模型，该模型中krasV12的高表达激活了肝中Ras-Raf-MEK-ERK 及Wnt／β-catenin信号通路，触发了HCC 的发生。 值得注意的是该转基因斑马鱼模型的HCC 潜伏期相对较长，在9 月龄的成鱼中，HCC 的发生率也不到30%。 此外，tp53缺失可加速krasV12转基因斑马鱼HCC 的发生，但肿瘤发病率并没有增加，这同样证实tp53 突变并非斑马鱼HCC 的触发因子，而在HCC 的发展过程中发挥重要作用。

极光激酶A（Aurora A，AURKA）是有丝分裂进程的主要调节因子，对中心体成熟和纺锤体的稳定起重要作用［31－32］。 近年来又发现其可通过激活上皮-间质转化（ epithelial-mesenchymal transition，EMT）以及细胞干性重编程来促进肿瘤细胞转移［33］。 2019 年，Su 等［25］构建了AURKA（V352I）和AURKA（WT） 两种转基因斑马鱼，发现AURKA（V352I）转基因斑马鱼在3 个月时便诱导出了纤维化标志基因col1a1 的表达，7 个月形成HCC，而AURKA（WT）转基因斑马鱼则需要9 个月才能进展到HCC 阶段。 该研究表明，突变型的AURKA（V352I）可能对于HCC 的早期发生具有重要作用。

β-catenin 是经典Wnt 信号通路的重要组成部分，β-catenin 突变可能与HCC 的起始有关［34］。2015 年，Evason 等［26］在斑马鱼肝中特异性过表达爪蟾突变型β-catenin，在4 ～5 月龄时斑马鱼生存率显著降低，部分个体表现出肝体积增大、肝细胞核膨大以及核轮廓不规则等组织学异常。 在6 月龄时斑马鱼肝结构被严重破坏，表现出与人类HCC 相似的病理学特征，因此，该品系可作为临床上β-catenin 突变诱导的HCC 模型，用于相关药物筛选或机制研究。

持续的病毒感染是HCC 形成的主要原因。HBx 是乙型肝炎病毒（HBV）的X 抗原，其过表达可诱导小鼠出现HCC 的表型，且src可作为共同调节因子参与HBx 诱导的小鼠HCC 的发生［35－36］。 在TP53 缺失突变的背景下，同时过表达HBx 和src能够诱导斑马鱼在5 月龄时出现HCC，高脂饮食饲养时，HCC 比例增加［27］。 值得注意的是，单独过表达HBx 或src，仅能诱导斑马鱼肝细胞增生或畸形，但无法直接诱导出HCC 的表型。 这可能是因为斑马鱼并非HBV 的宿主，体内不存在相关受体。

持续表达型转基因斑马鱼HCC 模型可很好地模拟人类HCC 的发生，并用于测试药物的抗癌效果，也可作为潜在精准医疗的药物筛选平台。 但持续过表达致癌基因，易导致胚胎缺陷，这将使研究长期的癌症进展以及维持转基因品系变得较为困难。

2.3 诱导型转基因斑马鱼肝细胞癌模型

为了克服上述持续表达型HCC 模型的缺点，研究者进一步开发出了诱导型转基因HCC 模型，可控制致癌基因表达时间及表达量，从而随时控制肿瘤的起始及进展。

Nguyen 等［37］、Emelyanov 等［38］尝试使用米非司酮诱导的LexPR 系统控制krasV12在斑马鱼肝中特异性过表达。 研究者通过调整米非司酮的浓度可控制krasV12基因的表达水平，同时，通过控制何时加入米非司酮，可实现在斑马鱼任意发育阶段启动肿瘤的发生［37］。 研究发现，利用2 μmol／L 米非司酮处理krasV12转基因斑马鱼1 个月后，可100%诱导出HCC。 值得注意的是，撤除米非司酮后，HCC 的表型可恢复。 除了krasV12转基因斑马鱼，研究者们还建立了其他基因的米非司酮诱导表达品系，如tgfβ1a转基因品系、myca和mycb转基因品系［39－40］等。

四环素诱导的Tet-on 系统是斑马鱼HCC 模型中另一个常用的诱导表达系统，被用于控制krasV12、xmrk和小鼠Myc等基因在斑马鱼肝中特异性表达［7，41－43］。 Xmrk 是剑尾鱼黑色素瘤受体激酶，其蛋白结构与人表皮生长因子受体（EGFR）高度相似，在肝癌发生中起着重要作用［44］。 癌基因Myc与HCC 不良预后相关，被认为是人类肝肿瘤恶性转化的关键［45］。 在四环素诱导后，上述3 种转基因品系均表现出肝迅速肿大，以及肝肿瘤形成。 其中krasV12和xmrk品系诱导的大部分肿瘤可进展为HCC，而小鼠Myc诱导的则大多是肝细胞腺瘤。

单一致癌基因过表达的转基因模型可以稳定地诱导斑马鱼HCC，但肿瘤转移现象甚少发生。Twist 是一种碱性的螺旋－环－螺旋转录因子，与癌症患者的低生存率相关，在诱导EMT 过程中发挥重要作用［46］。 2020 年，Nakayama 等［47］构建了米非司酮诱导的Twist1-ERT2／xmrk双转基因斑马鱼，在三苯氧胺处理时，约80%的双转基因斑马鱼通过诱导EMT 在5 d 内发生肝癌细胞扩散，甚至长距离迁移到躯干和尾部，在部分鱼中，甚至还观察到了继发性肿瘤的建立。 类似地，twist1a ／krasV12双转基因斑马鱼也表现出自发的肿瘤转移， 脂多糖（lipopolysaccharides， LPS） 处理可增加肿瘤细胞转移［48］。

结合上述两种诱导型转基因表达系统可有选择性地激活不同的致癌基因，这种策略不但可以研究多种候选基因的致癌功能，还可以有效规避诱导物对下游实验的可能干扰。 值得注意的是，单一的诱导表达系统依赖于诱导物的持续暴露，这通常会导致斑马鱼所有的肝细胞全部发生恶性转化，与人类癌症发生的实际情况不符。 结合米非司酮诱导的krasV12模型和Cre／loxP 系统，只需短暂暴露于米非司酮，便可诱导Cre-loxP 介导的永久性基因组重组［49］。 由于Cre 酶介导的基因组重组往往是不完全的，可使krasV12在肝部分细胞中特异性表达。 在这个诱导系统中，斑马鱼肝会出现不同的肿瘤结节，肿瘤病变过程与经致癌物处理的斑马鱼十分相似，能够更好地模拟人类HCC 的形成过程。 因此，在进行实验设计时需要明确实验目的，选择合适的诱导表达系统来建立斑马鱼HCC 模型。

3 斑马鱼的肝细胞癌异种移植模型

构建肿瘤异种移植模型是研究肿瘤进展和测试新疗法的重要途径。 相较于遗传学模型，异种移植模型的造模周期更短，且供体细胞多为人源肿瘤细胞系或来自于患者的肿瘤组织，更利于测试人的肿瘤细胞对药物的敏感性，因此临床应用前景更广阔。

大多数斑马鱼HCC 异种移植模型使用永生化细胞系作为供体，评估肿瘤细胞增殖、转移、血管新生、肿瘤微环境等。

3.1 斑马鱼幼鱼的肝细胞癌异种移植模型

斑马鱼受精后1 个月左右后天免疫系统才完全发育成熟［50］。 所以，异种移植肿瘤细胞到斑马鱼幼鱼体内，可免受免疫系统排斥，移植成功率较高。

目前，多数研究选择将人肝癌细胞系注射到受精后2 d（days post fertilization，dpf）的幼鱼卵黄囊以评估其体内增殖能力，并测试药物对肝癌细胞的抑制能力［51－53］。 2016 年，Tseng 等［51］将Huh7 细胞注射到2 dpf 的斑马鱼幼鱼卵黄囊，并用不同浓度的茚［1，2-b］喹喔啉衍生物处理，结果发现其能够在斑马鱼内体发挥良好的抗肿瘤效果。 采用类似的方法，Liu 等［52］和Xu 等［53］又分别发现苦豆碱和茶褐素对HCC 细胞的生长均有一定的抑制作用。

研究者也可通过对HCC 细胞系进行目的基因敲降或过表达后，再构建异种移植模型，从而评估基因对肿瘤转移能力的影响［54－56］。 甲硫氨酸腺苷转移酶2β（MAT2B）基因在肝癌组织中高表达，并且在临床上与肝癌患者的不良预后相关。 2019 年，Wu 等［54］在多种HCC 细胞系中敲降MAT2B基因，然后构建斑马鱼HCC 异种移植模型。 结果发现沉默MAT2B可通过部分抑制EGFR 信号通路抑制HCC 细胞在体内的转移和侵袭，提示MAT2B可以作为HCC 新的预后标志物和治疗靶点。 2021 年，Akbari 等［55］构建了过表达G 蛋白偶联受体5（LGR5）的Huh7 细胞系，并将其植入斑马鱼卵黄囊，结果发现过表达LGR5 时Huh7 细胞转移率更高。 采用类似方法，研究者发现在人肝癌细胞系SNU-449 中过表达HOX 转录物反义基因间RNA（HOTAIR）基因会促进肝癌细胞在斑马鱼体内的转移［56］。

除了评估肝癌细胞在体内的增殖与转移能力，斑马鱼异种移植模型同样适用于评估肿瘤细胞引起的血管新生。 2016 年，Tonon 等［57］将具有较强侵袭性的人HCC 细胞株JHH6 注射到2 dpf 的血管绿色荧光品系斑马鱼幼鱼卵黄囊，通过荧光观察及血管染色，并对血管内皮生长因子及其受体基因进行定量分析，发现该模型可重现肝细胞癌的促血管生成能力，且该模型可用于测试血管新生相关药物如硼替佐米的抗HCC 效果。

斑马鱼幼鱼异种移植模型还可用于进行规模化药物筛选。 2020 年，Nakayama 等［47］利用转移性HCC 斑马鱼模型从67 种FDA 批准的药物中筛选出一种HSD11β1 的抑制剂——肾上腺甾酮，并证实肾上腺甾酮的确可通过抑制HSD11β1 的表达来抑制HCC 的体内转移。

虽然利用斑马鱼幼鱼构建肿瘤异种移植模型已经取得了一定的成效，但该模型仍存在一定的局限性。 首先，注射到卵黄囊的肿瘤细胞无法与周围的组织细胞进行交互，难以模拟体内肿瘤生长的真实环境。 因此，迫切需要评估斑马鱼胚胎不同移植部位对肿瘤细胞增殖、迁移以及血管新生的影响，以确定合适的研究方法。 其次，斑马鱼后天免疫系统发育成熟后，移植的肿瘤细胞终将被杀死。 因此，针对幼鱼肿瘤移植模型的研究只能局限在较短时间内，不利于研究肿瘤发展的长期过程。 最后，斑马鱼幼鱼体积较小，每次只能植入几十到几百个细胞，往往这些细胞是不包含肿瘤干细胞的，这使得移植的肿瘤细胞难以持续生长。 在优化斑马鱼幼鱼肿瘤细胞移植方法的基础上进行PDX 模型的构建，并测试特定患者对临床药物的敏感性，将会推动斑马鱼PDX 模型的临床应用。

3.2 斑马鱼成鱼的肝细胞癌异种移植模型

为了克服上述幼鱼模型的局限性，研究者们开发了斑马鱼成鱼的肿瘤异种移植模型，此模型必须使用免疫抑制或免疫缺陷的成鱼作为受体［10，58－65］。构建免疫抑制或免疫缺陷成鱼常用的物理化学方法包括利用γ 射线或地塞米松等药物抑制免疫细胞功能，遗传学方法主要是通过敲除免疫相关功能基因，构建免疫缺陷斑马鱼突变品系。

斑马鱼对γ 射线的生物反应与哺乳动物非常相似，研究发现，在大约20 Gy 的辐照剂量下，斑马鱼淋巴组织内的细胞在1 周内大部分会被消融，但这并不是永久性的，所有造血细胞会在1 个月内恢复。 接受辐照处理的斑马鱼在仅移植5 × 103个白血病细胞时便可出现明显的恶性转化，而未接受辐照处理的斑马鱼在植入高达5 × 106个白血病细胞后也未出现白血病表型，提示植入的白血病细胞可能遭到受体免疫系统排斥并被清除［58］。

除了利用物理射线抑制免疫系统功能，有研究者使用化学药物地塞米松处理斑马鱼，发现其淋巴细胞功能可被显著抑制，在植入人乳腺癌细胞（MDA-435）、纤维肉瘤细胞（HT1080）以及小鼠黑色素瘤细胞（B16）后，出现了不同程度的细胞侵袭、血管新生及致死效应［59］。 2019 年，Khan 等［60］尝试使用白消安抑制斑马鱼成鱼髓系系统，发现可以提高肝细胞癌和急性髓系白血病细胞的移植成功率，在移植15 d 后，肿瘤细胞依然可以正常存活。

相对于通过物理方式或化学药物抑制斑马鱼免疫系统，直接构建免疫缺陷突变体更具有应用前景。 2014 年，Tang 等［61］构建了斑马鱼rag2E450fs突变体，该突变体缺乏成熟的功能性T 细胞，且B 细胞数量显著减少，但其生存能力和繁殖能力基本不受影响。 不但造血干细胞、肌肉细胞等正常细胞可以在rag2E450fs突变体中稳定存活，包括白血病细胞、横纹肌肉瘤细胞以及黑色素瘤细胞等多种肿瘤细胞同样可在其体内稳定生长。

Prkdc基因编码DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基，其在DNA 非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复中发挥重要作用。 2016 年，Jung等［62］利用TALENs 技术敲除了斑马鱼prkdc基因，发现prkdc缺失突变体的V（D）J 重排缺陷，导致B 淋巴细胞和T 淋巴细胞分化停滞，该模型可用于移植人的多种肿瘤细胞。 2016 年，Sertori 等［63］发现敲降斑马鱼白细胞介素-2 受体γ 链基因il2rga会影响幼鱼早期T 淋巴细胞的成熟，但不会影响B 细胞的成熟，且敲降下游酪氨酸激酶编码基因jak3 会出现类似的结果。 2022 年，Sertori 等［64］和Basheer等［65］分别利用TALENs 和CRISPR／Cas9 技术敲除了斑马鱼il2rga及jak3 基因，证实二者的缺失突变均可影响T 淋巴细胞及NT 细胞的成熟，将人结直肠癌细胞HCT116 移植到il2rga突变体中，18 d 后仍能观察到大量的肿瘤细胞。

2019 年，Yan 等［10］在缺乏色素细胞的Casper品系的背景下构建了prkdc及il2rga的双敲除突变体，该品系同时缺失了T、B 及NT 细胞，通过驯化使其能够适应37℃的饲养环境。 该品系不但可以用于构建多种人类肿瘤细胞系移植模型，而且适用于构建患者来源的肿瘤移植（PDX）模型。 通过病理学检测发现，该模型中肿瘤细胞的生长动力学及组织学特征与移植到NSG 小鼠中十分相似。 2020 年，Lv等［11］构建了foxn1／Casper突变体斑马鱼品系，其表现出T 细胞缺陷，允许包括造血干细胞、肌肉等多种细胞类型的同种异体及异种移植，但其是否适用于人的肿瘤细胞移植尚未经过验证。

4 斑马鱼肝细胞癌模型的应用

HCC 是一种复杂的、异质性较强的肿瘤，常常存在多种遗传变异。 这些变异会导致细胞信号网络调控异常，触发肝细胞发生恶性转化和增殖。 斑马鱼的遗传背景及肝结构与人类高度相似，且易于进行转基因和基因突变等功能研究，是研究HCC 发生发展具体机制以及开发HCC 新疗法的良好模型。基于斑马鱼开发的HCC 模型存在但不限于以下4个方面的应用。

第一，斑马鱼HCC 模型可用于评估相关物质的致癌能力。 4-氨基联苯（4-ABP）是一种人类致癌物，会引起DNA 氧化损伤，抑制DNA 修复。 2022 年，Lin等［66］用Tg（fabp10a：HBx，src，p53－／－）斑马鱼HCC模型，发现低剂量反复暴露于4-ABP 可激活肝中Ras-ERK 通路，诱导或促进肝细胞癌的发生。

第二，通过构建斑马鱼遗传学HCC 模型可以进行HCC 的发病机制研究，挖掘新的治疗靶点。 2019年，Yang 等［67］在TO（krasG12V）诱导型斑马鱼HCC模型的背景下敲除了瘦素受体基因lepr，发现敲除lepr的斑马鱼经诱导HCC 后的存活率显著提高，且肌肉萎缩的水平显著降低，提示瘦素信号可作为HCC 患者肌肉萎缩的一个新的治疗靶标。

第三，斑马鱼HCC 模型可用于评估药物对肝癌细胞生长和转移的影响，进行药物筛选。 斑马鱼模型是高通量的体内研究模型，可以将肿瘤新药的体外实验和体内实验相结合，提高临床前药物开发的成功率，降低筛选过程所需的时间和成本。 二甲双胍（metformin）是治疗糖尿病的一种药物，de Oliveira等［68］利用Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑马鱼模型发现，高脂饮食会促进HCC 的进展，而二甲双胍可以调节肝微环境中的免疫应答，进而抑制饮食诱导的NASH 相关HCC 进展。

第四，利用斑马鱼构建患者来源的肿瘤细胞移植模型，可加快精准医疗的进程。 体外培养的肿瘤细胞系容易丢失肿瘤异质性和原发性肿瘤的基因特征，而PDX 模型使用患者来源的肿瘤细胞，可以保留原代肿瘤的大部分特征，具有较为精确的临床疗效预测性。 2022 年，Ali 等［69］构建了39 例非小细胞肺癌患者的斑马鱼PDX 模型，并测试了其对埃罗替尼及紫杉醇等药物的响应情况，结果发现该模型不但可以在3 d 内给出准确的疗效评估，还可以准确预测肿瘤细胞的淋巴管转移。

5 总结与展望

肝细胞癌是一种原发性恶性肿瘤，早期诊断比较困难，患者化疗效果较差，且其高复发、高转移率的特点常导致患者预后不良。 因此，迫切需要开发并建立良好的HCC 动物模型用于新药筛选及抗肿瘤药效评估。 斑马鱼繁殖能力强、易于饲养、胚胎透明、体外发育、后天免疫系统成熟较晚、遗传背景以及组织器官的发育与人类高度相似等优点使其成为构建各种人类疾病模型的良好模式生物。 通过在肝中过表达xmrk、HBx、myc、krasG12V等基因，结合米非司酮／四环素诱导系统或Cre-loxP 系统，已经建立了多种组成型或诱导型斑马鱼HCC 模型［7，36，43，49］。 斑马鱼后天免疫系统在30 d 左右才发育成熟，且目前基于Casper背景已开发出多种免疫缺陷突变体，利用斑马鱼进行肿瘤细胞移植，甚至构建PDX 模型用于肿瘤精准治疗已成为可能［10－11，69］。 构建斑马鱼HCC 模型已经成为研究肝细胞癌发生发展机制、开发新的治疗靶点以及进行新药筛选的强有力手段。

尽管利用斑马鱼HCC 模型已经取得了许多研究进展，但该模型仍存在一定的局限性。 第一，斑马鱼肝与人类肝虽然功能相似，但结构上存在一定的差异。 例如，斑马鱼肝中不存在Kupffer 细胞，且门静脉、肝动脉和大胆管在肝实质内随机分布，不像哺乳动物肝那样归为门管区。 因此，在今后的研究中需更加关注斑马鱼肝的微结构，明确其功能分区或异质性，以更加准确地模拟人类HCC。 第二，斑马鱼的肝很小，可用于实验分析的组织较少。 这就要求研究人员需要充分整合优化现有技术或者开发出更加精确、可针对微量样本的新技术进行相关指标的检测。 第三，在斑马鱼中，基于抗体的检测结果有时无法重复验证。 这可能是因为能够识别斑马鱼抗原的抗体十分有限，而在一些研究中使用了非斑马鱼特异性的抗体来进行检测。 因此，持续开发斑马鱼特异性的抗体仍然是一项任重道远的任务，联合相关企业进行共同开发或许会更快解决制约斑马鱼研究发展的这一瓶颈。

斑马鱼HCC 异种移植模型存在以下问题亟待优化：首先，斑马鱼适宜的饲养温度是28.5℃，这与人体生理温度有较大差距，肿瘤细胞在斑马鱼体内的增殖速度和组织学特征亦与人类不完全相同。当前的大部分研究都是在非生理温度下进行的，因此将斑马鱼驯化至适应37℃饲养环境或许能够更好地模拟HCC 细胞的生存条件；其次，斑马鱼血管无法完全模拟人HCC 的动脉血供应。 目前，通过生化／显微成像／免疫学分析可以模拟HCC 细胞发育的微环境特征，但尚无有效手段模拟HCC 的动脉样供血。 因此，在进行HCC 血管生成相关研究时，建议使用至少2 种细胞系，以提高研究结论的准确性。最后，斑马鱼HCC 异种移植的注射部位通常是胚胎卵黄囊或成鱼腹腔，而非肝。 这使得HCC 细胞在非肝环境中生长，无法排除斑马鱼体内其他因素的干扰，实验结论的可靠性有待提升。 因此，如何改善实验技术，实现斑马鱼肝肿瘤细胞原位移植是值得相关研究者关注的重点方向之一。