酶的固定化方法在微流控芯片技术中的应用*

仵静雯,陈 琳,刘春叶,张 剑

(西安医学院 药学院,陕西 西安 710021)

微流控芯片是药物研发中重要的高通量筛选平台。实现酶在微流控芯片上的固定化,对提高药物筛选可靠性尤为重要。随着20世纪60年代酶固定化技术的兴起,酶的固定化在酶分析中得到了广泛地应用。酶的固定化是指通过化学或物理方法处理,使酶与载体相结合,将自由酶限制在一定区域内,此时酶依然能进行特异性催化的技术。酶经过固定化后,可最大程度地保持酶的催化活性,克服了游离化酶存在的不足,在提高酶催化效率的同时又显示出许多独特的优势,如易分离回收,可连续、重复使用,稳定性高等[1]。固定化酶反应器的微型化可以更有效地缩短分析时间,减少酶和试剂消耗,降低分析成本[2]。

酶的固定化可提高生物活性及稳定性,是酶抑制剂类药物筛选结果可靠的前提。目前,酶抑制剂类药物被广泛使用,对该类药物的筛选及研究表征也日益成熟[3-6]。临床用于治疗阿尔兹海默症(AD)的药物主要为胆碱酯酶抑制剂[7],如加兰他敏、他克林、多奈哌齐和卡巴拉汀等,使用二维液相色谱与质谱检测结合毛细管固定化酶反应器反相分离技术,不需要对样品进行预处理[8]。

微流控芯片技术是通过生物学、化学、医学、电子、材料、机械等多学科交叉,将分子生物学、化学分析、医学等领域所涉及的样品前处理、分离及检测等过程集成到几平方厘米的芯片上,从而实现从样品前处理到后续分析的微型化、自动化、集成化和便携化的技术,具有样品消耗少、检测速度快、操作简便、多功能集成、体积小和便于携带等优点,在药物研发[9]、病毒检测[10]、医学诊断[11]、生物分析[12-13]、药物筛选及检测[14-15]、癌症肿瘤的治疗[16-18]等领域得到广泛应用。作者对常见酶固定化方法尤其是微流控芯片体系中酶的固定化方法进行综述,为酶抑制剂类药物筛选提供参考。

1 酶的常见固定化方法

1.1 包埋法

包埋法是通过物理作用,将酶固定在各种多孔载体(如高分子凝胶、金属有机骨架材料、聚合物膜等)中从而实现酶固定化的方法[2]。由于包埋过程不改变酶的结构和空间构象,也不发生化学反应,能较好地保持酶的活性,且操作工艺简单,被广泛采用[19-24]。目前,常用的包埋法根据包埋介质的不同可以分为凝胶包埋法[25-26]和微囊包埋法[27-28]。凝胶包埋法是指将酶包裹在凝胶形成的网格中,该方法操作简单,反应条件温和、机械稳定性较高。微囊包埋法是通过物理或化学方法将酶包裹在膜装置(如中空纤维或微胶囊)中的一种固定化方法,可以同时固定多种酶。该法一般操作简单,可以更好地维持漆酶的自身结构并保持长期稳定,是一种经济有效的方法。Dawesa等[20]通过光引发聚乙二醇二丙烯酸酯共聚而成的水凝胶对葡萄糖氧化酶进行包埋,在体外癌细胞培育过程中诱导产生低氧环境,保证了酶的活性。

1.2 物理吸附法

物理吸附法是酶通过分子间相互作用力(如氢键、疏水作用、范德华力、静电引力等)将酶吸附并固定在载体表面的一种酶固定化方法。Ji等[29]利用物理吸附法将漆酶固定到碳纳米管改性的聚偏氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。与化学交联法相比,物理吸附法制备的生物催化膜具有可重复装载的优点,经过4次漆酶重复装载后,生物催化膜的活力约维持在首次固定化酶活性的70%。物理吸附法作为一种较为成熟的酶固定化技术,已成功用于商业化[30]。

1.3 化学交联法

化学交联法是利用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法,通常是将酶先吸附或包埋在载体上/内,再利用化学交联以增强酶与载体之间的物理缠绕或化学连接。常用的双功能试剂有戊二醛(Glutaraldehyde,GA)、偶氮甲酰胺(Azodicarbonamide,ADA)、乙二胺(Ethylenediamine,EDA)、双偶氮联苯胺(Bisazobenzidine,BDB)等[31-33],其中GA是最常用的交联剂。Hilal等[33]采用过滤的方式将脂肪酶吸附到微滤膜孔内,再利用GA将膜内的酶进行交联固定化,所制备的生物催化膜载酶量高,且具有较高的稳定性。为防止交联过程中造成酶失活,导致回收率较低的缺陷,经常会在固定化前向酶溶液中加入底物、底物类似物、抑制剂,或向固定化系统中添加惰性蛋白,如牛血清蛋白、明胶等,作为酶的保护剂维持目标酶活性中心的天然结构,保证酶活性不变。

1.4 共价键合法

共价键合法是将蛋白的非活性基团(如氨基、羧基、巯基、羟基、酚羟基和咪唑基等)与固定化载体表面的官能团以共价键形式结合而完成固定化的方法[34-36]。孔丽云等[36]发明了一种基于共价键合法固定捕获抗体的纸基酶联免疫吸附法,用于检测人血液中类过敏相关屏障组织中肥大细胞上表达的受体(MRGPRX2)含量,其定量结果准确性、重现性良好,适用于临床检测和血液流行病学调查。共价键固定化酶呈现良好的稳定性及重复使用性,是目前研究较多的一类酶固定方法。但该方法一般反应条件较高,操作复杂,往往会引起酶蛋白高级结构发生变化而影响酶的活性。

综上所述,酶作为一种催化剂广泛应用于各行各业,同时在生命活动中发挥十分重要的作用。由于酶容易失活,对反应环境要求高,难以广泛的在工业及生物学研究中进行运用。同时生命体内微量蛋白的含量低且不易提取,对微量蛋白进行高效催化和检测成为当前急需解决的问题,微流控芯片上酶的固定化为解决这一问题提供了支撑。

2 微流控芯片上酶的固定化

自1990年瑞士的Manz和Widmer首次提出微型全分析系统以来,微流控芯片因其集成小型化与自动化程度高、高通量、检测试剂消耗少、样本量需求少、污染少等优点,在生物医学研究、临床诊断、药物分析、食品安全、环境监测、法医和军事等领域显示了良好的应用前景。微流控芯片将全分析型的实验室微型化到芯片系统,可完成样品预处理、反应、注射、分离和检测等分析步骤[37-38]。微流控芯片体系中酶的固定化为酶抑制剂类药物的筛选提供了保障。微流控芯片中通常使用溶胶-凝胶包埋技术将酶固定在微流控芯片通道内表面,其缺陷是由于酶的固定不是通过共价键,存在容易流失、影响酶解效果等问题。

2.1 物理固定化方法

微流控芯片体系酶的物理固定化方法在保留传统物理方法的同时,充分利用了微流控体系自身的结构特征[1,39-41]。Kim等[39]使用微阵列固定过氧化酶过程中,将流速控制在1～10 μL/min,利用微珠作为载体,将酶固定在该载体上,再将固定酶的微珠悬浮于一定比例的液体中,注入芯片微通道中,通过机械障碍过滤方法将微珠固定在芯片微通道的特定区域。如果使用磁性微珠,则可通过外加磁场将其固定到通道的目标位置[40]。

2.2 化学固定化方法

利用芯片基底材料表面官能团和酶的氨基酸残基之间形成共价键可将酶固定在微通道表面。目前微流控芯片多用玻璃或聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS),其Si—OH基团可与交联剂或酶上的氨基酸残基通过共价键进行结合[41-46]。Liang等[43]在微流控纸芯片上制备了复合比色免疫装置,首先用壳聚糖溶液对纸张表面进行处理,采用原位还原法在微流控纸芯片检测区固定花型磁性纳米金颗粒(FLAuNPs-Pd/Fe3O4@C),再借助捕获抗体(Ab1)和二抗(Ab2)分子中的氨基将其固定在纳米金表面(纳米粒子主要用以提高单位面积抗原加载量),最后通过位点选择性对抗体进行筛选,完成了癌胚抗原和α-甲胎蛋白的高灵敏度检测。Wang等[44]用壳聚糖处理纸张表面,借助双功能试剂将抗体以共价键修饰到微流控纸芯片(μPADs)检测区,实现了μPADs上的夹心化学发光免疫分析(CL-ELISA)实验,对血清中癌胚抗原和α-甲胎蛋白进行了检测。由文献可知,和抗原抗体类似,均需要对纸张表面进行壳聚糖处理,引入大量氨基,再借助双功能试剂实现酶的固定化,才能实现酶分子在纸张表面的共价键合。

通过抗生物素-生物素表面化学可将固定化过程集成到微流控芯片中[46-49],降低价格昂贵抗体等生物样本消耗量(100 ng),提高固定速度(1 min)。该固定过程可以在微流控芯片上自动执行,操作简单易行。

通过分层组装技术,也可实现酶在微流控芯片中的固定。Liu等[49]基于一种新开发的全液相微流控芯片,该芯片由纳米表面活性剂(NPS)在两相系统中的界面组装而成。采用分层组装策略在微通道表面生成多糖多层膜,以辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶为模型,构建了全液相微流控酶反应器和级联反应器,证明了多糖多层膜在提高酶负荷和催化效率方面的关键作用。

Zhang等[50]通过酶与聚丙烯酸(Polyacrylic acid,PAA)结合并将其加入海藻酸盐基微纤维中,可以显著抑制酶的泄漏,实现酶的稳定性键合,提高酶的回收率和热稳定性。此外,利用这些酶的级联反应,在优化条件下制备了葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)负载的微纤维,用于c(葡萄糖)=0～2 mol/L的可视化检测。由于可调性和多功能性,这种基于微流体的微纤维平台,用于级联催化和多种临床标志物的诊断。

Gong等[51]首次在微通道反应器中应用流动的悬浮固定化酶进行生物催化。在微通道中流动的功能化形式的石墨烯固定化柚皮苷酶在异槲皮苷生产中取得了优异的结果,流动性悬浮石墨烯片固定化酶具有高度持久的特异性和温和的催化特性,使酶的重复利用成为可能。

化学交联法也被应用在微流控芯片体系酶的固定化中。Hickey等[52]使用2种酶交联反应,将氨酰化酶成功固定在微流控通道中,用于生产稳定的生物催化微反应器,可在几个月内重复使用。

3 结束语

微流控芯片是一种集成、快速、高效、高通量、试剂用量小的技术平台,将极大地促进生物分析及药物评价筛选的研究。酶的固定化可提高其生物活性及稳定性,是酶抑制剂类药物筛选结果可靠的前提。微流控芯片上酶的固定化通过化学键、次级键、物理吸附及生物学的方法,将酶固定在特定的载体上,同时保证酶的活性。相比于常见固定化方法,其具有微型化的特点,大大减少了酶与反应物的用量,具有固定化酶的优势,使酶可以重复利用,同时又提高酶的稳定性,操作简单且容易控制,易自动化且低耗高效。对微流控纸芯片体系的制备及应用进行简单总结,旨在对酶在纸张上的固定化进行思考,进一步扩大微流控纸芯片在酶抑制剂类药物筛选中的应用。