雷帕霉素对高糖高脂诱导的MIN6细胞铁死亡的研究

杨瑞瑞,王浩,陆恒,李海燕,王同玲,张丽媛,郭恒,丁玉松

(石河子大学医学院预防医学系,新疆 石河子 832000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一种胰岛素的绝对或相对不足的代谢综合症。在T2DM发病过程中,年龄、超重或肥胖、体力活动不足等危险因素,引起机体肌肉、脂肪及外周组织发生进行性胰岛素抵抗,进而引起机体糖脂代谢紊乱[1]。胰岛β细胞对糖脂毒性极为敏感,当患者明确诊断为T2DM时,胰腺功能已显著降低[2]。尽管做了大量研究,但是糖脂毒性导致胰岛β细胞死亡的机制并未完全阐明。因此,探讨行之有效的干预策略,对于T2DM的防控具有重大的公共卫生学意义。

早期研究显示,凋亡是糖脂毒性诱导的β细胞死亡以及胰腺功能衰竭的主要机制[3],然而Bellini等[4]研究发现,现有抗凋亡干预只能部分缓解糖脂毒性导致的β细胞死亡,提示糖脂毒性诱导β细胞损伤存在新的死亡方式。Li等[5]发现T2DM模型小鼠胰岛β细胞存在铁死亡,免疫组化染色显示铁沉积在胰岛中心,电镜显示胰岛线粒体缩小,嵴丢失等铁死亡特征性表现。张丽媛等[6]研究显示高糖高脂诱导胰岛β细胞发生铁死亡。因此,胰岛β细胞铁死亡可能成为T2DM的潜在干预靶点,具体机制有待进一步研究。

研究发现,自噬参与调节铁死亡[7]。Sheng等[8]研究显示在糖尿病C57BL/6小鼠中,高糖高脂饮食使胰岛β细胞发生氧化应激产生大量ROS,使微管相关蛋白l轻链3Ⅱ(Microtubule-associated protein1 light chain3,LC3Ⅱ)和P62表达升高阻断自噬流,使β细胞对高糖高脂更为敏感,导致β细胞功能障碍。Liu等[9]的研究表明,胶质细胞成熟因子β诱导视网膜色素上皮细胞自噬流阻滞,使酰基辅酶A 合成酶长链家族成员4 (acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)累积,导致细胞发生铁死亡。Liu[10]研究发现在C57BL/6小鼠脑损伤模型中,自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)干预可通过激活自噬改善铁死亡。因此本次研究选取小鼠胰岛瘤细胞株MIN6细胞,通过添加外源高糖和棕榈酸钠(high Glucose and high Sodium Palmitate,GP)模拟糖尿病微环境,建立体外胰岛β细胞损伤模型,以自噬激动剂RAPA进行干预,探讨自噬激动剂RAPA能否通过激活自噬改善高糖高脂诱导的小鼠β细胞铁死亡,为T2DM的防治提供新的思路及干预靶点。

1 材料与方法

1.1 主要材料

小鼠胰岛瘤细胞株MIN6细胞购自上海富衡生物科技有限公司(XF0390)。胎牛血清和1640培养基购自美国 Gibco 公司,CCK8试剂盒购自Biosharp公司,谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒、DCFH-DA 探针和Lillie染色检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所,自噬激动剂RAPA购自美国selleck生物科技有限公司,铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)、铁死亡激动剂(erastin,Era)、凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)、坏死抑制剂(necrostatin-1,Nec-1)均购自美国MCE公司,谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4 货号:ab125066),ACSL4(货号:ab155282),铁蛋白(Ferritin,FE 货号:ab75973)抗体购自美国Abcom公司;LC3(货号:14600-1-AP)、P62(货号:18420-1-AP)购自武汉三鹰生物技术有限公司。鼠抗β-actin购自武汉博士得生物工程有限公司。羊抗兔IgG,羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。葡萄糖和棕榈酸钠购自西安鲲创科技有限公司。

1.2 检测方法

1.2.1 细胞培养

用含90% 1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗+0.1% β-巯基乙醇培养MIN6细胞,置于培养箱(37 ℃,5% CO2)24 h后观察细胞数量与形态。选取70%～80%密度的细胞进行后续试验。

1.2.2 实验分组

将MIN6细胞分为以下6组(1)对照组:完全培养基培养,(2)GP组:25 mmol·L-1高糖+200 μmol·L-1高脂,(3)RAPA组:完全培养基+RAPA 60 nmol·L-1,(4)GP+RAPA组:25 mmol·L-1高糖+200 μmol·L-1高脂+RAPA 60 nmol·L-1,(5)Era组:完全培养基+Era 20 μmol·L-1,(6)GP+Era组:25 mmol·L-1高糖+200 μmol·L-1高脂+ Era 20 μmol·L-1。

1.2.3 CCK8法检测细胞活力

将MIN6细胞按7 000个·孔-1接种于96孔板中,每组设5个复孔,按照分组施加不同处理24 h后,各孔加入10 μL的CCK8溶液,避光孵育1.5 h后,在酶标仪450 nm波长处测定吸光度,计算细胞存活率。

1.2.4 GSH,MDA和SOD的检测

将MIN6细胞按1×105个·孔-1接种于6孔板中,待提取细胞上清及BCA法测蛋白浓度后,分别按照试剂盒说明书操作,GSH含量测定采用微量酶标法。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法。SOD活力测定采用WST-1法。

1.2.5 ROS水平测定

将MIN6细胞按5×104个·孔-1接种于24孔板中。将药物干预24 h的细胞与2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)分子探针(1 μmol·L-1)在37 ℃下孵育45 min,然后用PBS冲洗3次。使用荧光显微镜收集荧光图像(×200)。用DCFH-DA (10 μmol·L-1)法测定细胞 ROS 水平。

1.2.6 细胞中亚铁含量测定

用Lillie染色试剂盒检测细胞二价铁离子,药物干预24 h后,按照试剂盒说明书操作,使用荧光显微镜收集荧光图像(×400)。

1.2.7 Western blot 检测铁死亡、自噬相关蛋白

在六孔板中加入预冷的PBS洗涤一次,然后每孔加入150 μL的RIPA裂解液于冰上裂解30 min,超声破碎离心20 min(4 ℃、12 000 g)收集细胞上清,使用BCA测定总蛋白含量,然后加入总体积1/4的5×上样缓冲液配平,最后置于100 ℃金属浴煮10 min备用。配置12%分离胶及浓缩胶,加入适量蛋白后恒压电泳电转适量时间后,5%脱脂奶粉常温封闭2 h,TBST洗涤3次。分别使用一抗GPX4、LC3、P62(1∶1 000)、ACSL4(1∶10 000)、FE(1∶600)4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次。加入相应的二抗(1∶20 000)室温孵育2 h。TBST洗涤3次,最后使用ECL化学发光法进行曝光,使用ImageJ分析所有的条带。

1.3 统计分析

采用SPSS26.0软件进行统计分析,Graphpad Prism8.0软件绘图。数据服从正态分布用均数±标准差进行描述。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni法。P<0.05,为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GP诱导MIN6细胞发生铁死亡

根据课题组前期研究[6],本次选用25 mmol·L-1高糖和200 μmol·L-1棕榈酸钠处理细胞,建立损伤模型,在此基础上,进一步使用Fer-1(铁死亡抑制剂)、Era(铁死亡激动剂)、Nec-1(坏死抑制剂)、Z-VAD-FMK(凋亡抑制剂)干预MIN6细胞24 h,使用CCK8检测细胞活力。见图1A,与对照组相比,GP组细胞活力明显降低(P<0.05)。

A. 细胞存活率;B-D. 铁死亡关键蛋白(GPX4,ACSL4及其定量);E-F. ROS荧光(×200)及定量;G-H. 亚铁离子表达(×400)及定量。*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),#表示与GP处理组相比差异显著(P<0.05)。图1 GP对MIN6细胞铁死亡的影响

与GP组相比,Fer-1显著提高细胞存活率(P<0.05)。而凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、坏死抑制剂Nec-1对MIN6无改善作用。Era被认为是经典的铁死亡激动剂,与GP联用,使细胞存活率进一步降低(P<0.05)。铁死亡是一种铁和ROS依赖的细胞死亡,为了进一步证明GP诱导MIN6细胞发生铁死亡,检测了ROS、亚铁离子含量及铁死亡关键蛋白的表达,如图1B～图1H所示,与对照组相比,GP使MIN6细胞产生大量ROS及亚铁离子,使GPX4表达降低,ACSL4表达增加,而给予Era干预后,进一步增加了ROS及亚铁离子的含量,使GPX4表达进一步降低,ACSL4表达进一步增加(P<0.05)。以上结果说明,GP诱导MIN6细胞发生铁死亡。

2.2 RAPA对GP诱导的MIN6细胞的存活率的影响

使用不同浓度的RAPA(0～100 nmol·L-1)干预MIN6细胞24 h后,如图2所示,与0 nmol·L-1组相比,10～60 nmol·L-1RAPA 对MIN6细胞存活率无影响(P<0.05)。为了观察60 nmol·L-1RAPA对GP诱导的MIN6细胞是否具有损伤,使用60 nmol·L-1RAPA联合GP干预细胞24 h后,结果显示与GP组相比,联合干预可改善MIN6细胞存活(P<0.05)。因此,本次研究选择60 nmol·L-1RAPA进行后续实验。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),#表示与GP处理组相比差异显著(P<0.05)。图2 RAPA对GP诱导的MIN6细胞存活率的影响

2.3 RAPA对GP诱导的MIN6细胞氧化应激的影响

β细胞抗氧化酶较少,极易受到氧化损伤,为了评估MIN6细胞的氧化损伤,本次采用试剂盒检测GSH、MDA含量及SOD活力。由图3可知,与对照组相比,GP组GSH含量和SOD活力均降低,MDA含量升高(P<0.05);与GP组相比,RAPA干预后GSH含量和SOD活力在一定程度上得到恢复,MDA含量降低(P<0.05)。提示RAPA可改善GP诱导的MIN6细胞氧化损伤。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),#表示与GP处理组相比差异显著(P<0.05)。图3 RAPA对GP诱导的MIN6细胞氧化应激的影响

2.4 RAPA对GP诱导的MIN6细胞ROS的影响

铁死亡的发生依赖于ROS的累积,为了检测MIN6细胞内ROS水平,使用DCFH-DA荧光探针检测MIN6细胞内ROS含量的变化。

由图4可知,与对照组相比,GP处理MIN6细胞后,细胞内绿色荧光增多,ROS明显增加(P<0.05);经RAPA干预后,细胞内绿色荧光减弱,ROS明显减少(P<0.05)。提示RAPA可以清除部分ROS。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),#表示与GP处理组相比差异显著(P <0.05),ROS荧光,×200。图4 RAPA对GP诱导的MIN6细胞ROS的影响

2.5 RAPA对GP诱导的MIN6细胞亚铁离子的影响

发生铁死亡时出现铁离子的累积,为了检测GP诱导MIN6细胞内Fe2+含量的变化,使用Lillie染色法检测细胞内亚铁离子,由图5可知,对照组有少量亚铁离子Fe2+,经GP干预后,MIN6细胞内出现大量阳性细胞(P<0.05);与GP组相比,加入RAPA处理后,阳性细胞数量减少,Fe2+含量显著降低(P<0.05)。提示GP诱导的MIN6细胞存在铁稳态失衡,而RAPA可以改善亚铁水平。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),#表示与GP处理组相比差异显著(P<0.05)亚铁离子染色,×400。图5 RAPA对GP诱导的MIN6细胞亚铁离子的影响

2.6 RAPA对GP诱导的MIN6细胞自噬相关蛋白LC3、P62的影响

LC3Ⅱ和P62是自噬标志物,由图6可知,经GP干预24 h后,与对照组相比,MIN6细胞内自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达水平升高,自噬底物P62蛋白表达水平升高(P<0.05)。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),#表示与GP处理组相比差异显著(P<0.05)。图6 RAPA对GP诱导的MIN6细胞自噬相关蛋白LC3、P62的影响

提示GP诱导的MIN6细胞内自噬增加,自噬流阻滞,而RAPA干预后LC3Ⅱ蛋白表达水平升高(P<0.05),P62蛋白表达水平降低(P<0.05),提示RAPA激活自噬,使自噬流通畅。

2.7 RAPA对GP诱导的MIN6细胞铁死亡的影响

FE是细胞内储存铁的主要蛋白,对于维持细胞内铁稳态具有重要作用,GPX4、ACSL4是铁死亡标志蛋白。由图7可知,经GP干预24 h后,与对照组相比,MIN6细胞内铁死亡关键蛋白GPX4降低、ACSL4、FE蛋白表达水平升高(P<0.05),而RAPA干预使GPX4升高,ACSL4、FE蛋白表达水平降低(P<0.05),提示RAPA可改善GP诱导的MIN6细胞铁死亡。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),#表示与GP处理组相比差异显著(P <0.05)。图7 RAPA对GP诱导的MIN6细胞铁死亡的影响

3 讨论

T2DM是胰岛素抵抗和β细胞分泌受损相互作用的结果,高糖和高脂是T2DM微环境的主要特征[11],可引起胰腺组织结构和功能损伤,使胰岛β细胞数量减少、分泌能力下降、功能障碍[12]。Elksnis等[13]的研究表明,ROS大量累积及β细胞功能障碍与T2DM病程呈负相关。Stancic等[14]的研究显示在糖尿病模型中发现铁死亡与胰岛β细胞损伤有关。目前广泛关注GP诱导胰岛β细胞凋亡[15]的研究,关于GP诱导胰岛β细胞发生铁死亡研究相对较少,具体机制并未完全阐明。自噬参与T2DM的发生发展,激活自噬,有利于保护β细胞死亡,Bugliani等[16]研究显示自噬激动剂RAPA可降低P62表达,激活自噬,改善T2DM患者胰岛β细胞功能和存活。Yu等[17]的研究发现,RAPA使氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞激活自噬,改善铁死亡。本研究中发现GP诱导MIN6细胞产生大量ROS及脂质过氧化物(MDA),使自噬流阻滞及铁死亡。而铁死亡抑制剂Fer-1及小剂量的RAPA提高细胞存活率,抑制了GP诱导的MIN6细胞铁死亡。

铁死亡的特征是氧化还原性铁的积累、GPX4的失活和脂质过氧化物积聚[18]。FE通过储存细胞内过量的亚铁以维持细胞铁稳态,Zhang[19]等人对上海江川社区的横断面研究发现,血清铁蛋白升高是T2DM的独立危险因素。细胞高浓度的铁是导致铁死亡的关键,铁离子可通过fenton反应产生大量ROS,过量ROS导致脂质过氧化和氧化应激。秦璐[20]等人研究显示高脂诱导的MIN6细胞Fe2+含量升高。本研究显示GP导致MIN6细胞Fe2+含量及FE表达上升。研究显示,GPX4是一种抗氧化酶,可维持细胞内氧化平衡,防止脂质过氧化及GSH耗竭,从而抑制ROS生成发挥抗铁死亡作用[21]。本研究显示,GP诱导MIN6细胞GSH含量、SOD活力及GPX4表达降低。研究显示,ACSL4催化长链脂肪酸导致脂质过氧化物累积,使细胞发生铁死亡[22]。Ansari等[23]的研究表明,ACSL4集中分布在人和大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌颗粒周围。本次研究发现GP诱导MIN6细胞,ROS水平、MDA含量及ACSL4表达升高,提示高糖高脂诱导的MIN6细胞发生铁死亡。

研究显示,自噬在调节铁死亡中起关键作用,其通过铁自噬[24]、脂噬[25]及分子伴侣介导的自噬[26]上调铁水平、脂质过氧化及促进GPX4降解导致铁死亡。LC3Ⅱ和P62被广泛用于表征自噬,是自噬标志物。当自噬小体形成时,LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化,随着自噬小体与溶酶体融合,LC3Ⅱ逐渐降解;因此LC3Ⅱ表达增强可能是自噬增强或自噬降解障碍,因此需结合P62水平评估自噬水平,P62表达与自噬活性负相关[27]。Zhang等[28]的研究显示GP诱导的MIN6细胞自噬流阻滞,表现为P62升高。研究显示,自噬流阻滞使ROS累积,导致β细胞功能障碍[29]。Conlo等[30]研究显示ROS及脂质过氧化导致细胞发生铁死亡。Song[31]等人研究显示自噬标志物核心调节因子通过上调脂质过氧化抑制Xc-系统导致癌细胞发生铁死亡。Zeng等[32]研究显示,镉暴露产生过量ROS和脂质过氧化,导致TM3细胞铁死亡及自噬流阻滞。本次研究结果显示GP组细胞LC3Ⅱ及P62表达升高,提示GP诱导的MIN6细胞存在自噬流阻滞,而自噬激动剂RAPA干预MIN6细胞使LC3Ⅱ、GPX4水平升高及P62降低、ACSL4水平降低,提示RAPA可以改善GP诱导的β细胞铁死亡。

然而RAPA对胰岛功能的影响仍存有争议。Tanemura等[33]的研究表明10 ng·mL-1的RAPA使GFP-LC3转基因小鼠胰岛细胞LC3Ⅱ表达增多,上调自噬,抑制胰岛素分泌,导致细胞死亡和胰岛β细胞功能障碍。而Deng等[34]研究表明,100 nM的RAPA改善高糖和高脂诱导的MIN6细胞胰岛素分泌,调节葡萄糖耐量,防止细胞死亡,与本研究结果一致。Yu等[17]的研究发现,10 μmol·L-1的RAPA干预0.5 h,激活自噬,抑制氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞铁死亡,与本研究结果一致。本次研究结果显示60 nmol·L-1的RAPA可提高MIN6细胞存活及抗氧化酶GSH、SOD水平,降低MDA水平,减少细胞氧化损伤,抑制GP诱导的β细胞铁死亡。以上两种不同结局的原因可能与RAPA不同剂量、不同作用持续时间及种属差异有关,后续需要进一步的研究进行论证。

综上所述,本研究在细胞层面上证实了铁死亡参与GP诱导的MIN6细胞损伤,其机制可能与自噬流阻滞有关。而雷帕霉素可能通过激活自噬,改善β细胞铁死亡。本研究存在一定的局限性,仅在细胞层面验证GP诱导胰岛β细胞发生铁死亡和自噬的作用,未在动物或原代离体胰岛内进行验证;此外,还需进一步探讨GP诱导β细胞铁死亡-自噬的分子机制,为T2DM的防治提供一定依据和干预靶点。