线粒体移植治疗神经系统疾病的策略及机制*

郑倩雯 杨雁灵 王亚云

（1）空军军医大学第一附属医院肝胆胰脾外科，西安 710032；2）空军军医大学基础医学院，教学实验中心，神经系统疾病线粒体机制研究实验室，西安 710032）

线粒体（mitochondria）是绝大多数细胞的生物能量合成装置，通过氧化磷酸化（oxidative phosphorylation， OXPHOS） 产 生 三 磷 酸 腺 苷（adenosin triplosphate，ATP）为细胞供能。同时，线粒体还在脂肪酸生物合成、细胞钙的缓冲、活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生及氧化应激（oxidative stress）中发挥重要作用［1-2］。既往研究表明，线粒体形态或功能异常参与多种临床疾病，包括心血管系统疾病（心肌肥大、冠状动脉粥样硬化、心肌梗死等）［3-4］、代谢疾病（糖尿病、肥胖等）［5-7］、恶性肿瘤（肝癌、肺癌、肠癌等）［8-10］和泌尿系统疾病（肾衰、肾炎）［11］等。其中，线粒体异常对神经系统造成的损伤格外令人关注，究其原因在于脑对线粒体的高度依赖性。

脑是体内耗氧量最大器官，其基本生物学功能包括神经递质释放及突触可塑性等，而以上活动均需依赖大量ATP 分子［12］。研究表明，人的单个皮层神经元每秒耗能多达47亿个ATP分子［13］，兴奋性（谷氨酸能）神经元消耗大脑80%～85%的ATP，而抑制性神经元和其他细胞消耗其余15%～17%的ATP［14］。在神经元的突触前和突触后结构、轴突起始段、郎飞结节点以及生长锥等高耗能区，其对ATP的实时足量供应提出了更加苛刻的要求。与此同时，在ATP 产生方面，神经元具有与其他体细胞截然不同的特点，即其所需93%ATP分子来源于线粒体有氧呼吸的三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle），也称柠檬酸循环（citric acid cycle）或Krebs 循环，仅有7%ATP 分子来源于不依赖线粒体的胞质有氧糖酵解过程（aerobic glycolysis）。不仅如此，线粒体还通过调控钙离子稳态、参与细胞凋亡、介导氧化应激等机制，发挥调控神经元突触可塑性的重要作用。由此可见，线粒体的稳定性已成为神经系统稳态的重要基础，而线粒体的形态或功能异常可导致神经传递异常，最终引起多种神经系统疾病［15-16］。大量研究表明，帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、亨 廷 顿 氏 病（Huntington’s disease，HD）、中风（stroke）和创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBⅠ）［17-19］等多种神经系统疾病的发生发展均与线粒体结构与功能障碍密切相关，通过恢复线粒体稳态以纠正神经系统功能异常已成为前沿研究及临床治疗的热点问题。

1 靶向线粒体治疗神经系统疾病的5种主要策略

目前，靶向线粒体治疗神经系统疾病的策略主要涉及以下5个方面（表1）：a.基于线粒体氧化应激致神经系统损伤的机制，使用对抗线粒体氧化应激或增强抗氧化应激的药物［20-24］，如MitoQ和十二烷酸（decanonic acid）等，用于治疗AD 和肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）；b.基于线粒体过分裂增多致线粒体损伤进而引起神经系统稳态失衡的机制，使用抑制线粒体分裂或融合的药物［25-26］，如Mdivi-1 等，用于治疗AD 和PD；c.基于线粒体产生不足导致神经系统损伤而使用增加线粒体产生的药物［27-28］，如三环吡酮和线粒体相关蛋白质拮抗剂1（dynamin-related protein antagonist 1）等，治疗AD 和HD；d.使用线粒体保护分子［29-33］，如致酮分子（ketogenic molecules）BHB （d-β-hydroxybutyrate） 直接治疗AD、PD、ALS； e.使 用 胰 岛 素 增 敏 剂 （insulin sensitizers）［34-35］二甲双胍（metformin）促进线粒体功能恢复以及促进脑能量生成，从而治疗AD和HD。

Table 1 Five strategies of mitochondria-targeted treatment for neurological diseases表1 靶向线粒体治疗神经系统疾病的5种主要策略

2 线粒体移植治疗神经系统疾病的研究进展

与此同时， 线粒体移植（mitochondrial transplantation）通过补充健康线粒体修复神经系统被认为在治疗神经系统疾病方面具有巨大潜能，受到越来越大的关注。线粒体移植是将外源性健康线粒体以直接或间接方式移植进入受损机体，通过改善神经系统呼吸功能进而修补受损神经系统，最终达到改善和治疗神经系统疾病的目的。线粒体移植最早并非用于神经系统疾病。1982 年，Clark 和Shay［36］首次尝试从对两种抗生素（氯霉素和埃夫拉肽素）具有抗药性的细胞中纯化线粒体，然后将其与对此两种抗生素不具有抗药性的细胞共孵育，结果发现，受体细胞获得了对以上两种抗生素的耐药性，由此开启了利用线粒体移植治疗各类疾病的新篇章。迄今为止，关于线粒体移植治疗临床疾病的最具震撼性研究是2017 年，美国波士顿儿童医院首次对5 名依赖体外膜氧合支持（extracorporeal membrane oxygenation support，ECMO 支持）的严重心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion injury）患儿，将其自体腹直肌分离提纯线粒体进行心脏直接注射［37］，术后2名患儿先后死亡，但是3名患儿成功脱离ECMO并生存良好。

本文系统回顾了PUBMED 上正式报道的线粒体移植治疗神经系统疾病的所有研究，共搜索到26篇密切相关参考文献（图1）。

Fig.1 Major research reports and history of mitochondrial transplantation in the treatment of neurological disorders图1 线粒体移植治疗神经系统疾病的主要研究报道及历程

根据在体与体外两种水平将以上线粒体移植研究分为两大类型。

2.1 线粒体移植治疗神经系统疾病的在体研究

2.1.1 线粒体移植治疗神经系统疾病的类型

目前报道线粒体在体移植能够有效治疗的神经系统模型包括11 种（表2）：大脑中动脉闭塞脑缺血再灌注模型［38-42］、局灶性脑缺血模型［43］、创伤性脑损伤模型［44-45］、精神分裂症模型［46-47］、抑郁症模型［48］、糖尿病认知功能障碍模型［49］、PD 模型［50］、老年小鼠［51-53］、脓毒症模型［54］、神经挤压模型［55-56］及脊髓损伤模型［57-59］。由此可见，线粒体移植报道最多的领域是缺血及损伤类动物模型。考虑推测当中枢神经系统发生缺血或损伤时，动物局部应对危机的大量系统开始启动应激以展开自我保护程序，此时原有的线粒体数量已经不能满足脑和脊髓迅速增加的紧急需求，因此出现线粒体能量合成不足、钙稳态失衡、神经元突触可塑性受损，从而导致神经系统无法有效纠正能量危机，最终引起神经元网络全面中断。此时早期给予外源性线粒体补充，能够快速有效纠正线粒体数量不足与功能缺陷，特别对能量合成、钙稳态，以及突触可塑性具有重要的改善作用，最终通过挽救神经系统的能量危机，使神经系统恢复重要功能。

Table 2 Research of mitochondrial transplantation in the treatment of neurological diseases in vivo表2 线粒体移植治疗神经系统疾病的在体研究

文献还可见线粒体移植能够治疗精神类疾病或者认知障碍类疾病动物模型。考虑到这些模型的制备也是用化学药物所诱导的情况，因此推测，线粒体移植治疗这类疾病的病理生理学基础也同样在于原有线粒体数量不能满足中枢神经系统损伤后大规模增加的能量需求，此时给予外源性线粒体能够解决该主要矛盾，从而产生有效结果。

目前尚未见线粒体移植治疗AD、HD 的研究报道，这与这两类疾病已经有明确线粒体参与机制的现状相矛盾。这一方面可能在于线粒体移植研究仅在有限的实验室开展实施，另一方面可能在于目前使用的AD 和HD 小鼠模型多为转基因小鼠，该小鼠的神经系统能量危机可能出现于最早期，之后由于无有效缓解途径从而发生了更为复杂的次级灾害。也就意味着，如果能够在早期利用线粒体移植可能还有挽救神经系统损伤的机会，而到疾病成熟阶段再单纯使用补充线粒体的办法可能已经无法纠正神经系统广泛的功能异常。令人遗憾的是，目前尚无法获得线粒体移植的时间窗口，因此，推测未来在该领域的尝试也将非常艰难。

2.1.2 线粒体移植的方式

根据移植线粒体的来源可将以上研究中采用的线粒体移植方式分为直接移植和间接移植两种。直接移植是指移植的是线粒体本身，间接移植是指移植携带线粒体的其他载体。用于直接移植的线粒体来源包括3种，分别是各细胞系、人脐带间充质干细胞以及同种异体组织。其中，组织来源线粒体取自于骨骼肌、胎盘、肝脏、脑、血小板等5 种类型。在体研究中仅有1 例采用骨髓间充质干细胞［58］作为线粒体载体实施移植。以上线粒体直接移植能够发挥有效治疗作用的结果充分证实，具有独立双层膜结构的线粒体可不需要特殊载体或细胞携带而作为单独功能性单元进行移植操作，这为未来线粒体移植治疗各类型疾病提供了实验室依据。同时，来源相异的线粒体可以发挥相似治疗效应的结果也提示，未来进行线粒体移植治疗神经系统疾病时，线粒体来源是否来自于神经系统这一点不需进行重点关注，而更应关注于移植使用的线粒体的数量是否足够以及结构是否均一。

从目前结果判断，胎盘来源的线粒体可能在人类线粒体移植中具有最重要意义。2022 年12 月Minovia 公司和以色列舍巴医疗中心的研究人员合作［60］，在Science Translational Medicine发表了一篇封面论文。该研究首先将胎盘来源健康线粒体移植到单个大规模线粒体DNA 缺失综合征（SLSMD）患儿的CD34+造血干细胞，进行线粒体扩增，然后将扩增的造血干细胞回输给患儿。单个大规模线粒体DNA缺失综合征（SLSMD）会导致多种毁灭性疾病，包括Pearson 综合征（PS）和Kearns-Sayre综合征（KSS），这些线粒体疾病是散发的，目前尚无法治愈，并最终导致患者死亡。前者通常在婴儿期发病，并导致一半患者死于婴儿期或儿童期，而幸存者通常会发展为后者，成为一种进行性多系统疾病，伴随着视力、听力障碍、心脏疾病、胃肠道障碍、痴呆、肌肉无力，直至死亡。而在该项研究中，6 名接受治疗的患儿中，4 名患儿的外周血异质性下降，所有6名患儿在治疗后6～12 个月时外周血细胞线粒体DNA 含量的增加，2名患儿在治疗后有氧功能改善，治疗前体重非常低的6名患儿中有5名体重增加；而且这项治疗具有良好的安全性和耐受性。结合该项报道及现有研究结果推测，胎盘来源线粒体移植可能是未来线粒体移植治疗神经系统疾病的首选策略。

线粒体移植入体内的方式包括6种（表2）：动脉注射（颈内动脉和股动脉）、脑室注射、静脉注射、玻璃体注射、神经外膜注射、脊髓注射。注射的次数不一，有单次注射，也有连续注射多次。注射的线粒体含量不一，以线粒体蛋白质为计数单位的注射剂量报道中最小100 μg绝对量或1 mg/kg相对量，最大750 μg绝对量或5 mg/kg相对量。以线粒体数量为计数单位的注射剂量大约1×106～1×107。以上结果可见，脑室内注射一般进行一次即可见效，而血管内注射通常需要多次注射才能起效。说明，线粒体从循环系统进入中枢神经系统需要耗时更长，中间损耗情况更为严重。这为未来线粒体移植的具体策略提供了思路。

线粒体移植后发挥治疗或者改善效果的时程在报道中差异很大，短的有2 h，长的有90 d。移植后的效果均为减轻动物的疾病程度（表2）。研究多用线粒体探针MitoTracker 验证线粒体是否进入体内（表2）。部分研究证实了线粒体功能的好转（表2）。考虑到线粒体移植产生效果的证据是神经系统的氧化应激得到缓解、能量合成得到补充、神经元突触传递得到改善，而这些指标的恢复或者改善都需要神经系统运行稳定后才能够显示出来，因此推测，线粒体移植到达靶区后，可能立即发挥能量合成、调控钙稳态以及稳定突触可塑性的功能。如果此时原有线粒体伤亡较小，新移植线粒体的补给就可以完全纠正原有损伤，结果表现为发挥效应；若此时原有线粒体伤亡较大，新移植线粒体的补给尚不能完全纠正原有损伤，结果表现为尚未发挥效应。对于后一种情况，推测随着时间推移，新移植线粒体可通过分裂以产生新鲜线粒体，或通过与受损较轻线粒体融合以产生新鲜线粒体，最终通过数量充分的正常线粒体的补充，最终发挥缓解疾病的效应。因此，未来研究中，应加强对线粒体移植后早、中、晚期等不同阶段线粒体动力学、线粒体发生相关分子群的检测，勾勒出移植线粒体在体内的修复路径与分子事件，从而为精准实施线粒体移植提供分子工具。

同时，以上结果提示，线粒体移植在体治疗的实验方案尚存在较大分歧，后续关于线粒体质量控制等方案的规范化探索将成为重要的研究方向。

油田注水开发到了高含水期，由于油藏压力的变化、注采井网的变化和不同区域不同方向注采程度的变化，导致了油藏储层物性和油气水三相流体饱和度发生变化，剩余油分布呈现总体零散局部富集的特征。油田开发表现为单井产量逐步降低，含水快速升高，开发成本上升，效益下降。

2.2 线粒体移植治疗神经系统疾病的体外研究

目前有3篇研究报道了线粒体移植对体外培养神经元的保护效应。将源自大鼠新鲜大脑提取的突触小体作为线粒体传递系统与CCCP或鱼藤酮处理的LAN5 细胞系共培养［61］，JC-1 探针结合流式细胞仪证实细胞线粒体膜电位水平恢复；将源自间充质干细胞的提取线粒体与小鼠原代培养皮层神经元共培养［62］，能够改善氧化应激致神经元损伤；将源自人肝癌细胞提取的线粒体与人神经瘤母细胞系共培养［63］，能够改善MPP＋致神经元氧化应激损伤。

以上体外研究结合在体研究证实，线粒体移植能够有效阻断各种应激所致神经系统损伤的节奏，有望为神经系统功能恢复赢得宝贵的时间。

3 线粒体移植治疗疾病的生物学机制

无论是线粒体直接移植还是以突触体或星形胶质细胞作为载体的间接移植，无论是经脑内注射还是经静脉/动脉注射，健康线粒体最终要发挥效应都需要其能够进入到受损神经元内部，即神经元能够“吞噬”健康线粒体。迄今为止，共发现线粒体进入细胞的两种生物学机制（表3）：隧道纳米管（tunneling nanotubes， TNTs） 和 细 胞 外 囊 泡（extracellular vesicles，EVs）。

Tabel 3 Biological mechanisms of mitochondrial transplantation表3 线粒体移植的生物学机制

3.1 隧道纳米管（TNTs）

TNTs 特指直径在50～200 nm 的狭细通道，以肌动蛋白为结构基础，呈现丝状伸展，可发自于细胞、线粒体或内质网等各种膜性结构。线粒体TNTs 是线粒体发出的纤细管状结构，可与毗邻线粒体形成物理性接触，允许多种分子进行单向或双向传输，以单向为主［66］。目前观察到间充质干细胞来源的线粒体可经TNTs 进入气道上皮细胞［67］，还可见心肌细胞来源线粒体经TNTs 进入内皮祖细胞［68］，以及神经元内线粒体经TNTs转移到星形胶质细胞［69］。以TNTs为桥梁的线粒体移植被证明可以改善多个线粒体活性参数，包括ATP水平、线粒体膜电位、线粒体耗氧量。基于TNTs 的线粒体移植在缺血再灌注损伤［70］、肾小管细胞分化［71］及肿瘤［72］中得到了证实。目前认为，细胞外蛋白S100A4［73］及其受体高级糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end product，RAGE）、黏连蛋白connexin 43（Cx43）［74］、线粒体 受 体 蛋 白1 （mitochondrial receptor protein，Miro1）等［75］分子以及Ras不依赖的鸟嘌呤核苷酸交换因子（Ras-independent guanine nucleotide exchange factor for RalA GTPase，RalGPS2）-Akt-PDK1等［76］通路参与了TNTs的形成与维持。

3.2 细胞外囊泡（EVs）

EVs是由细胞释放到外部环境的膜性囊泡，其内部含有蛋白质、脂类和核苷酸，参与细胞间通讯。根据直径大小不同将EVs 分为3 类：直径30～100 nm 的外泌体（exosomes），直径100 nm～1 μm的微泡（microvesicles）以及直径1～2 μm的凋亡小体（apoptotic body）［65］。有报道骨髓间充质干细胞来源的线粒体通过外泌体促进线粒体生物生成进而改善骨关节炎［77］。Spees 等［78］首次应用荧光标记法观察到人间充质干细胞分泌含有线粒体的微泡到培养液中，被受体细胞吞噬；另有证据表明，受损细胞从微泡中获得功能性线粒体［79-80］。目前关于凋亡小体参与线粒体移植尚未见报道。

无论是通过隧道纳米管机制还是通过细胞外囊泡机制，外源性线粒体要进入细胞内部都必然会发生胞膜与线粒体外膜的接触，接触后的线粒体还要与胞膜结构发生解离后才能成为胞质内独立单元，而在以上接触与解离生物学事件中是否存在特异性分子的相互识别目前尚无定论，这也将成为未来该领域的研究热点与前沿。

4 线粒体移植治疗神经系统疾病尚需解决的关键问题

4.1 线粒体来源

前已述及，目前报道的用于线粒体移植的线粒体来源非常丰富，包括细胞系、人脐带间充质干细胞以及同种异体组织，组织来源包括骨骼肌、胎盘、肝脏、脑、血小板等。说明在此方面尚无共识，更导致未来研究中对于评估线粒体移植的效应方面缺少统一标准，这是急需解决的关键问题之一。前已述及，胎盘来源线粒体可能在临床应用中具有重大潜力。

4.2 线粒体移植方式及数量

前已述及，线粒体移植入体内的方式包括：动脉注射、脑室注射、静脉注射、玻璃体注射、神经外膜注射、脊髓注射。注射次数包括有单次注射或多次注射。注射线粒体有以线粒体蛋白质为计数单位，也有以线粒体密度为计数单位，且所用数量均无统一标准。值得注意的是，2018 年在大鼠脊髓损伤线粒体移植研究中报道［57］，移植后的缓解效应与移植的线粒体浓度之间存在显著正相关性，即线粒体输注越多，效果越好。因此提示，线粒体移植中采用的方式及线粒体数量是未来研究中急需解决的关键问题之一。前已述及，直接注射较间接移植效率更高，所需线粒体数量更为经济。

4.3 线粒体的储存

线粒体虽然是一个具有双层膜结构的独立细胞器，但其对刺激非常敏感，研究证实，线粒体储存于冷藏或冷冻状态超过1 h，其外膜和内膜就会发生损伤［81］，导致线粒体氧化磷酸化功能及ATP 供应能力显著下降，甚至出现线粒体膜通透性及死亡。因此，进行线粒体移植时安全有效保存线粒体就格外重要。Gnaiger等［82］认为，将线粒体冷藏在以HEPES-蔗糖为基础的缓冲液中可有效保证线粒体具有较好呼吸功能，且能够维持24 h，但是最长不能超过2 d。有报道比较了将线粒体保存于4℃的进行人体器官移植时使用的University of Wisconsin缓冲液与Eurocollins 缓冲液［83］，结果表明，在维持肝脏线粒体复合物ⅠⅠ的活性方面，University of Wisconsin 缓冲液优于Eurocollins 缓冲液。Greiff等［84］观察到将线粒体储存于-65℃的10%二甲基亚砜（DMSO）中18 d或-65℃的10%甘油中15 d，线粒体氧化磷酸化能力能够很好维持；Nukakla等［85］进一步利用电镜证实-65℃的10% DMSO 中的脑源性线粒体内膜和外膜完整。未来有必要针对线粒体的储存进一步优化方案。

4.4 免疫反应

部分研究认为不存在免疫反应。支持该结论的研究包括：2017年波士顿儿童医院团队［37］在实施患儿线粒体移植治疗严重心脏病时，观察了免疫反应，未见移植后TNFα、ⅠL-6 和高敏感性C 反应蛋白等炎症标志物升高，也未检测到抗线粒体抗体；2017年，Kaza等［86］将自体线粒体移植到猪缺血再灌注模型后，将血清细胞因子水平作为移植后免疫反应指标，也未观察到其升高；2019年，Ramirez-Barbieri等［87］将同种异体线粒体单次或多次注射入小鼠腹腔，未见炎性细胞因子升高。

但是，也存在相反观点。2018 年，Pollara等［88］观察到接受线粒体移植后小鼠体内炎性因子增高；2019 年，Lin 等［89］报道线粒体可以激活血管内皮细胞产生炎性因子，接受线粒体移植的小鼠心脏出现显著免疫排斥反应。

5 展 望

由于线粒体移植治疗神经系统疾病在不到十年的时间里取得了较大成效，并且其操作较为简单，因此被认为有巨大临床应用价值。本篇综述预测，未来研究将陆续揭示线粒体移植中的线粒体质量控制策略及其分子和细胞机制，并且将形成线粒体移植的临床规范化诊疗方案。