养殖场非洲猪瘟自检实验室操作规范及关键点

周小钰，陈海军，蔡东森，徐伟风，李开军

1.南京市畜牧家禽科学研究所，江苏南京 210036；2.南京市畜牧技术推广站，江苏南京 210036

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种高度接触传染性疾病，由于目前非洲猪瘟依然没有有效的疫苗和药物进行防治，检测、扑杀、隔离是阻断非洲猪瘟传播的唯一途径，因此病毒检测在养殖场生产环节中发挥至关重要的作用。荧光PCR 方法检测非洲猪瘟病毒核酸具有特异性好、操作简单、成本低、结果准确可靠等优点。但在实际检测过程中可能会由于操作不规范等导致检测结果出现偏差，进而影响判断，甚至可能会造成环境的污染。为了防止交叉污染，确保检测结果的准确性，本文总结了检测前准备、检测过程、检测结束后处理的操作关键点及相关注意事项，为养殖场开展非洲猪瘟自检工作提供参考依据。

1 检测前准备

1.1 检测实验室布局要求

养殖场检测实验室应远离生产区，按照《非洲猪瘟常态化防控技术指南》中养殖场非洲猪瘟自检实验室建设规范的内容要求进行合理的区域划分，包含准备区、核酸提取区和核酸扩增区，各区域内均设有紫外消毒设备。

1.2 检测人员必要条件

实验室检测人员需熟悉非洲猪瘟检测流程及要点，并接受实验室分子生物学检测技术及生物安全相关知识培训，培训合格后方可上岗。

1.3 实验室主要配置

每间实验室均准备专用工作服、无菌乳胶手套、一次性口罩、鞋套和帽子、稀释后的84 消毒液、75%的酒精、废液桶等，注意各区域的仪器、耗材等禁止交叉使用。准备区主要配置衣柜或衣架、鞋架等；核酸提取区主要配置核酸提取仪、高速离心机、涡旋仪、恒温水浴锅及配套耗材用于检测，冷藏冷冻冰箱用于检测试剂、检测样本等保存，高压灭菌器用于检测废弃物处理；核酸扩增区主要配置荧光PCR 仪及配套耗材等。

1.4 试剂及耗材准备

提前准备好检测所需的试剂及耗材并检查各类试剂的有效期等，带滤芯的专用吸头和PCR 管等检测耗材需经过高压灭菌后使用。检测开始前60 min 将需用的移液器、无菌吸头和离心管等提前消毒好放入生物安全柜，并开启生物安全柜紫外灯照射消毒。在缓冲间准备好本次检测专用的实验服、一次性无菌口罩、一次性鞋套、乳胶手套等，实验室的地面、台面、生物安全柜等经75%酒精擦拭消毒后，开启实验室紫外照灯进行消毒。

2 检测过程操作规范

2.1 样本采集

科学采集样本进行检测，在做好工作人员及检测场所生物安全防护工作的前提下，严格按照中国动物疫病预防控制中心发布的《养殖场非洲猪瘟变异株防控技术指南》的要求采集样本，主要采集样本类型包括血液、组织、口腔液和拭子等。新鲜采集的样本需用专用容器密闭包装好后在2 ～8 ℃条件下尽快送检。

2.1.1 血液样本：使用含EDTA 抗凝剂的真空采血管通过猪前腔静脉、耳缘静脉或尾静脉采集猪全血（不可使用含肝素的采血管，避免影响检测结果），注意采集后颠倒混匀。

2.1.2 组织样本：用不同规格的离心管或自封袋采集组织样本，组织样本类型包括脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏等。

2.1.3 口鼻拭子：日常监测可采集猪口鼻拭子，对猪产生的应激和损伤小，使用无菌采样棉签插入猪的口腔或鼻腔中，棉签在口腔或鼻腔内旋转刮取后将其装入离心管中。

2.1.4 口腔液样本：对规模猪场育肥猪群等大栏可使用棉绳采集口腔液进行病原检测。在早上饲喂前将棉质绳子放入栏舍内，吸引猪来咀嚼，悬挂时间30 min 后将棉绳放入封口袋中，通过在袋内挤压棉绳收集口腔液，随后将袋内口腔液收集到离心管中。2.1.5 环境样本：使用棉拭子采集环境样本，主要针对猪场内易与外部环境接触的风险点，用生理盐水浸润的无菌棉签在环境表面擦拭后装入离心管中。液体环境样本直接用无菌吸管或注射器取适量液体至离心管中。

2.2 样本接收

样本接收过程需注意规范，避免对环境造成污染。实验室接收样本时，应先在外包装四周喷洒消毒剂，作用一定时间后取出样品包装袋及采样单等送至检测实验室并由检测人员及时做好编号或标注，避免混淆。样本接收完成后需对接样环境用紫外灯进行紫外消毒30 min 以上。接收的样本由检测人员带入实验室后直接放入生物安全柜，开始检测前必须确保生物安全柜保持开启且有效状态。

2.3 样本前处理

打开样本包装袋取样时动作不宜过大，防止气溶胶污染。不同的样本类型需采用不同的方式进行处理，抗凝血、血清、精液、口腔液等液体样本经高速冷冻离心机离心后取上清液用于核酸提取；固体组织样本经匀浆处理后离心取上清液用于核酸提取，不宜直接取样本原液进行检测，这样易造成检测结果不准确；拭子样本经稀释液充分浸润后取浸泡液用于核酸提取。样本处理结束后，剩余的样本用新的密封袋集中装好后做好标记并密封，包装表面喷洒消毒剂后于-20 ℃保存，根据实验室档案资料保存规范保存一定期限后再进行无害化处理。

2.4 核酸提取

2.4.1 样本的核酸提取可选择商品化病毒核酸提取试剂盒并按照试剂盒说明书的步骤进行操作，有条件的实验室也可使用核酸提取仪进行操作。

2.4.2 使用核酸提取试剂盒进行操作时，提前根据样品数量将核酸提取所需离心管置于管架上，检测过程中尽量不用手直接拿取离心管，如有需要，可用镊子夹取。

2.4.3 检测过程中不同的核酸提取步骤都应选择容量适宜的移液器和带滤芯的吸头，取样加样等过程要动作轻柔，防止加样过程中液体过多导致回流进而污染移液器。离心管内的样品量不宜过多且离心管开闭过程中动作要轻，防止管内液体溢出或造成气溶胶污染。

2.4.4 核酸提取过程中产生的废弃物、废弃吸头及离心管等要集中装在生物安全柜的废液桶内，废液桶内提前加入消毒剂并使废弃物浸泡在消毒液里。

2.4.5 操作过程应全程穿戴无粉无菌乳胶手套，若发生样本液体溢出等污染风险时必须及时更换手套并进行消毒，核酸提取步骤结束后更换乳胶手套进行下一步操作。

2.4.6 核酸提取后在室温环境容易降解，最好提取后立即进行PCR 检测。若不立即进行PCR 反应，需保存于-80 ℃，并尽快完成检测。

2.5 PCR 扩增反应

2.5.1 PCR 扩增反应可选择商品化非洲猪瘟PCR 检测试剂盒并按照试剂盒说明书进行反应体系配制及反应条件设置等操作，提前30 min 将PCR 检测试剂盒置于室温，需等到试剂盒内各反应液均充分回温溶解后开始检测。

2.5.2 检测人员将提取后的核酸送至核酸扩增区，人员在实验室内的流动按照准备区-核酸提取区-核酸扩增区的顺序单向活动，通过各区域间的传递仓定向传递样本，防止在样本转接过程中对环境造成污染。

2.5.3 提前根据检测样品量计算反应体系内各反应液的用量，选择容量适宜的移液器和滤芯吸头进行操作，加样加至PCR 反应管底部，应避免产生气泡，确保加样量和检测结果的准确性。

2.5.4 配制PCR 反应体系时必须使用带滤芯的吸头，最先加阴性对照并盖上PCR 管盖，所有待检样品核酸加完后，最后加阳性对照，所有加样完成后检查PCR 管盖是否盖紧。

2.5.5 PCR 扩增反应结束后不要打开PCR 管盖，直接弃置于医疗废弃物袋中，防止气溶胶污染，按照实验室生物安全相关要求进行处置。

3 检测后处理

3.1 检测废弃物处理

检测结束后，将所有废弃物品集中装于医疗废弃物袋中并密封，外表喷洒消毒后经121 ℃高压灭菌处理后移出实验室，按照医疗废弃物途径销毁。处理样本使用到的剪刀、镊子等可重复使用的物品，应放入塑料或不锈钢盒内，用消毒液浸泡30 min后再进行高压处理，处理结束后放回原处。

3.2 环境消毒

生物安全柜使用结束后用核酸祛除剂或75%酒精对内部及外部进行全面擦拭消毒，柜内通风运行10 min 后开启紫外灯照射消毒30 min。检测室内的地面、墙面及实验台桌面在检测结束后用核酸祛除剂或75%酒精整体喷洒消毒，人员离开检测室后开启紫外灯进行室内消毒。检测专用工作服需定期用消毒液浸泡清洗，且不得随意穿出检测室。

3.3 档案管理

检测结束后，如实填写检测报告和相关记录。若出现阳性结果，应按照《非洲猪瘟疫情应急实施方案（第五版）》相关要求和规定处置及溯源。检测记录和检测报告应真实、规范、完整，存档不少于24 个月。

4 小结

实验室检测技术已成为非洲猪瘟防控的关键环节之一。养殖场逐步规范和完善样本采集和实验室检测操作流程，可确保检测数据的真实可靠，对防控非洲猪瘟发挥重要作用，同时避免造成环境和样本的污染，以期指导生产工作，有条件的养殖场也可病原检测和抗体检测工作同时展开，为非洲猪瘟等重大疫病的监测提供科学准确的参考依据。