外源抗菌肽对木荷体内微生物和代谢物的影响

陈建桦

(福建省泰宁国有林场,福建 三明 354400)

木荷(SchimasuperbaGardn.et Champ.)为山茶科木荷属植物,是我国亚热带地区常绿阔叶林的主要优势阔叶树种[1],主要分布于浙江、福建、江西、贵州、湖南、广西、广东、海南等地[2]。木荷环境适应性强,利用价值高,用途广泛,树干通直,材质坚硬且不易变形[3-4]。此外木荷喜光,能抑制林下植被生长进而形成裸露地带,具备良好的防火阻燃效果,是一种优良的造林、用材以及防火树种[3,5]。但是长久以来,木荷人工林生长缓慢,且经营管理粗放,林分质量普遍不高[6],同时病害对木荷人工林的危害极大[1,7],虽然可以采取一些化学防治手段进行防治,但是仍然缺乏有效的高通量控制手段。

植物抗菌肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)主要是指由植物所产生的能够抵抗外界侵害的小分子多肽,被认为是最快速、普遍、直接和持久的对抗细菌、真菌、病毒等微生物以及各种动物和昆虫的屏障之一[8-9]。AMPs具有广泛的抗菌、抗真菌、抗病毒和抗癌活性,不仅可以作为直接杀微生物剂在宿主防御中发挥作用,而且还可以作为调节剂间接调节宿主免疫应答[10]。因此AMPs可以成为传统抗生素的一个很有前景的替代品[11]。近年来AMPs在多种农林作物中成功应用[12-16],成为高效、高通量、生态友好的抗病手段。

为验证抗菌肽对木荷内环境的影响,本研究通过添加通用抗菌肽的方式处理2年生木荷幼苗,并对其微生物与代谢物内环境进行分析,探索抗菌肽影响木荷的分子机制,以期为防治木荷病害及持续经营木荷人工林的生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于福建省泰宁国有林场,地处福建省西北边陲泰宁县(26°54′6.2928″N、117°11′29.4936″E),毗邻江西省的南丰、广昌、黎川等地,地形突兀,四周高中间低,呈阶梯式下降,海拔305—328 m,坡向西南,坡度18°左右。属于亚热带季风气候,表现出明显的山地气候特点,气温较低,冬季寒冷,夏季昼夜温差大。年均气温18 ℃,极端最高温40 ℃,极端最低温-11 ℃,年均降水量1765 mm,年积温5000 ℃左右,适合林木生长发育。

1.2 样本采集与处理

2021年11月,将2年生长势均衡、健康程度良好的木荷幼苗按照种植区域分为2部分;一部分叶片喷洒500倍抗菌肽双蒸水稀溶液作为处理组(T),另一部分在叶片喷洒双蒸水作为对照组(CK),以叶片开始有水珠滴下为准。抗菌肽由福建农林大学海峡联合研究院提供。

于2021年12月,采用五点取样法,在处理和对照组内分别采集10株木荷幼苗,进行表面消毒,先用75%的乙醇表面消毒1 min,迅速用无菌水涮洗3～5次;然后用30%的双氧水浸泡15 min;再次用无菌水涮洗3～5次,擦干表面水分,编号后封存于保鲜袋放入干冰中带回实验室,放于-80 ℃保存。

1.3 宏基因组学分析

1.3.1 DNA提取 将1.2中保存的木荷幼苗树干上、中、下部位各5 cm以及全部根部和叶片放入液氮中,按照MoBio DNA Isolation Kit(12855-50,MoBio,美国)说明书提取样品DNA。使用NanoDrop 2000 spectrophotometer(Thermo Fisher Scientifific,美国)测量DNA质量。在1%琼脂糖凝胶上检查DNA的完整性。提取的DNA在-80 ℃储存。

1.3.2 高通量测序 用Covaris ultrasonic crusher将DNA剪切至300 bp,对片段进行末端修复、A尾处理和Illumina兼容接头的连接处理。DNA测序文库在Allwegene公司(北京)的Illumina Hiseq平台上进行测序。运行后,使用Illumina分析管道版本2.6执行图像分析,基数调用和错误估计。

1.3.3 数据分析 原始数据的质量控制使用Trimmomatic[17]进行,包括删除适配器序列和低质量读取。如果读数与适配器序列,N(不确定碱基)比率大于1%,低质量碱基(Q≤20)含量大于50%,则过滤读数;并过滤掉质量控制后长度仍小于150 bp的读数。

将高质量序列与NR数据库进行比较,并使用diamond DIAMOND[18]工具将其分类为不同的分类群。使用MEGAHIT[19]组装测序数据,过滤掉低于500 bp的重叠群。使用Prodigal software[20]注释重叠群以预测开放阅读框(ORF),并使用CD-HIT软件[21]构建非冗余基因集。参照Bowtie等[22]将测序数据与非冗余基因集进行比较,统计不同样本中基因丰度信息。通过搜索功能注释数据库KEGG,COG/KOG,GO,CARD和CAZyme来注释基因功能。

1.4 代谢组学分析

1.4.1 代谢物提取 将1.2中保存的木荷幼苗树干上、中、下部位各5 cm以及全部根部和叶片放入液氮中,然后按照De VR等[23]描述的方案提取代谢物,设置3次技术性重复。

1.4.2 超高效液相色谱-质谱-质谱分析 使用配备Waters ACQUITY UPLC BEH酰胺柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)的安捷伦1290 Infinity Ⅱ系列UHPLC系统(安捷伦科技公司)进行分离[24]。流动相A为甲酸铵10 mmol·L-1、氨10 mmol·L-1,流动相B为乙腈。色谱柱温度设置为35 ℃、自动取样器温度设置为4 ℃、注射量为1 μL[25-26]。

1.4.3 数据分析 将在>50%的实验样品中检测到的代谢物特征从数据分析中删除;采用内标归一化方法,将原始数据的缺失值按最小值的一半补齐;将相对标准差(relative standard deviation,RSD)大于30%的特征从后续分析中删除。得到的涉及峰号、样品名称和归一化峰面积的三维数据被送入R软件包MetaboAnalystR进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal least squares discriminant analysis,OPLS-DA)。PCA显示了样品数据的分布。为了获得更高水平的群体分离,并更好地了解负责分类的变量,应用监督下的OPLS-DA,然后计算R2和Q2的值。R2表示一个变量的变化被解释的程度,Q2表示一个变量被预测的程度。之后,为了检查OPLS-DA模型的稳健性和预测能力,进一步进行了200次置换。为了完善这一分析,得到预测变量重要性的第一个主成分(Variable importance in the projection,VIP)。VIP值概括了每个变量对模型的贡献,VIP>1且P<0.05(t检验)和(FOLD CHANGE<0.67或FOLD CHANGE>1.5)的代谢物被认为是显著变化的代谢物。此外,利用商业数据库,包括KEGG(http://www.kegg.jp)和MetaboAnalyst(http://www.metaboanalyst.ca/)来搜索代谢物的路径。

2 结果与分析

2.1 微生物组学分析

2.1.1 微生物群落多样性分析 Alpha多样性可以反映微生物群落的丰度度和均匀度[27],外源施加抗菌肽后的木荷通过宏基因组测序分析(图1)表明,处理组的Shannon指数、Simpson指数、Invsimpson指数均显著高于对照组,说明施加抗菌肽显著提升木荷体内微生物的多样性和物种集中性。

不同小写字母为在P<0.05水平上差异显著(t检验)。图1 不同处理条件下微生物群落的α多样性指数box图

2.1.2 微生物群落组成 通过宏基因组测序分析得到的有效序列注释结果,共得到2个界、30个门、60个纲、98个目、167个科、320个属、932个种,根据样品物种注释的结果,选取各样品在目水平上相对丰度高于1%的物种,生成物种累积相对丰度图,以便更加直观地了解施加抗菌肽前后的木荷在目分类水平上相对丰度含量较高的菌种及分布的优势菌种。结果表明,施加抗菌肽前后的木荷在目水平(图2)主要分布有肠杆菌目(Enterobacterales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、生丝微菌目(Hyphomicrobiales)、红细菌目(Rhodobacterales)、芽孢杆菌目(Bacillales)以及球囊霉目(Glomerales)。

图2 不同处理条件下相关微生物群的样本目分类聚类柱状图

左边为样本间层次聚类分析;右边为样品的群落结构柱状图;横坐标为物种在该样本中的相对丰度;纵坐标为样本名称。图3 不同处理条件下相关微生物群的属分类聚类柱状图

2.1.3 微生物群落功能 利用Diamond软件将非冗余基因集序列与KEGG数据库进行基因同源性比对,对施加抗菌肽前后的木荷体内的功能基因进行注释。根据所有样品在KEGG数据库中的功能注释和丰度信息绘制显著差异功能热图(KEGG选取第3层级进行展示),并从功能和样品2个层级进行聚类(图3)。处理组有6条通路丰度比较高:糠醛降解通路(Furfural degradation),神经活性配体-受体相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction),铁载体基团非核糖体肽的生物合成(Biosynthesis of siderophore group nonribosomal peptides),金黄色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureus infection),鞘糖脂生物合成-神经节系列(Glycosphingolipid biosynthesis-ganglio series),糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定蛋白(Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins)。对照组有4条通路丰度比较高:二萜类生物合成(Diterpenoid biosynthesis),脂肪酸碳链延长(Fatty acid elongation),凝集素(Lectins),维生素的消化和吸收(Vitamin digestion and absorption)。

2.2 代谢组学分析

基于非靶向代谢组技术的代谢分析,在不同处理的木荷幼苗中共检测到2072个代谢物。采用UHPLC-MS/MS检测平台、本地数据库以及多元统计分析相结合的手段研究样品间的代谢物差异。

OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法。通过建立的判别模型,可以最大程度地反映分类组别之间的差异,从数据集中筛选出与分组相关的差异代谢物。从图4可以看出,2组样本得分差异显著[12],样本全部处于95%置信区间(Hotelling′s T-squaredellipse)内。第一个主成分的贡献率为84.7%,正交主成分得分为7.9%,2个贡献率之和为92.6%。主成分分析表明,处理组与对照组差异显著。

横坐标T_score为第一主成分的预测主成分得分;纵坐标Orthogonal_T_score为正交主成分得分;散点形状和颜色为不同的实验分组。图4 不同处理条件下代谢物的OPLS-DA图

每个点代表1个代谢物;横坐标为该组对比各物质的倍数变化(取以2为底的对数);纵坐标为t检验的P-value(取以10为底的对数)。散点颜色为最终的筛选结果,显著差异上调的代谢物以红色表示;显著差异下调的代谢物以绿色表示;非显著差异的代谢物为灰色。图5 不同处理间差异代谢物筛选火山图

横坐标为每条通路的Impact;纵坐标为通路名称。代谢通路分析结果以气泡图进行展示,气泡颜色为富集分析的P-value,颜色越红表示富集程度越显著;点的大小为富集到该通路的差异代谢物的个数。图7 不同处理的代谢通路分析

将筛选差异代谢物的结果以火山图(volcano plot)的形式进行可视化,结果见图5。共筛选到687个差异代谢物,其中上调的差异代谢物有233个,占比34%;下调的差异代谢物有454个,占比66%。

对OPLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)进行多元分析有助于初步筛选不同物种之间的代谢物。同时,结合单变量分析的P值和倍数变化(差异倍数变化值),进一步筛选品种间不同的代谢物,不同代谢物的VIP值显示前20个代谢物中,不同样本间差异较大(图6)。

根据上述富集结果,绘制富集到的KEGG通路的气泡图(只展示top20的结果),见图7。其中差异代谢物主要富集在ABC转运蛋白(ABC transporters)通路,花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)通路,类黄酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)通路,苯丙烷类生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)通路等。

通过以上分析得到的差异代谢物,在生物学上往往具有结果和功能相似性或互补性,或者受同一代谢通路的正调控或负调控,表现为在不同试验组间具有相似或相反的表达特征。对这类特征进行层次聚类分析,有助于将具有相同特征的代谢物归为一类,并发现代谢物在试验组间的变化特征。同时,聚类热图分析显示组内诱导代谢物的组成相似。处理组诱导的代谢物与对照组组成不同,这与抗菌肽的功能特点高度相关(图8)。

图中横坐标为不同样本;纵坐标为所有组合的差异代谢物;不同位置的色块为对应位置代谢物的相对表达量。 图8 不同处理的所有差异代谢物的层次聚类分析热图[17]

3 结论

抗菌肽是天然防御病原体的重要组成部分。这些肽的抗菌作用机制通常更为复杂。为了进一步研究抗菌肽在木荷中的功能,通过添加抗菌肽[19]后研究木荷体内的微生物和代谢物的变化来探讨抗菌肽对木荷影响的分子机制。

结果发现施加抗菌肽后,处理组的Alpha多样性显著高于对照组,说明施加抗菌肽后木荷体内的微生物的丰富度和均匀度显著上升且物种集中性更高,这与Bleecker等[28]的研究结果相反,进一步说明抗菌肽在木荷体内对细菌和真菌的病原体有抗性,具有抗菌的功能。在目分类学水平上,施加抗菌肽后木荷体内的优势菌目肠杆菌目、伯克氏菌目、生丝微菌目、红细菌目、芽孢杆菌目以及球囊霉目丰度显著(P≤0.05)升高。肠杆菌(Enterobacter)是溶磷菌的主要类群之一,有研究报道阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)是目前研究最广的种类,具有溶磷、分泌ACC转氨酶、合成植物激素IAA及防治病害等多种促生功能[29-31]。伯克氏菌目的细菌类群具有固氮和降解芳香族化合物的功能[32],近年来被认定是有益的微生物群落,但也是潜在的致病性微生物[33];伯克氏菌目和假单胞菌目已经被证实对某些细菌和真菌病原体具有高效的拮抗作用[34-35],因此,该细菌在病原菌的防御以及维持细菌群落稳定方面具有重要作用[36]。研究表明生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)和伯克氏菌科(Burkholderiaceae Comamonadaceae)均具有较强的固氮功能,可吸收利用大气中N2,说明固氮微生物可能在全氮和碱解氮含量较低的CK处理中具有较强的竞争力[37]。研究表明多粘类芽孢杆菌广泛生存在各种作物的土壤、根系、根际中,包括小麦、玉米,高粱、甘蔗和大麦中,其对多种植物病害具有良好的防控效果,被广泛运用在农业生产中[38],这与Das等[39]的研究结果相似,进一步说明抗菌肽在木荷体内的抗菌性,因此被认为是基本的、可诱导的植物防御屏障的组成部分[40]。芽孢杆菌目是农田土壤中的典型有益微生物种群,含有大量植物促生功能菌、病原拮抗菌等,可提高植物获取营养物质的效率,促进植物生长,同时抑制土传病原微生物侵染[41]。这与Dumas等[42]、Lix等[43]的研究结果相似,说明施加抗菌肽后木荷的抗逆性明显提高,有助于木荷的生长发育。球囊霉科(Glomeromycota)是分布最为广泛、研究最为深入的AM真菌,具有广泛的环境适应性[44]。

本试验对添加抗菌肽和对照组的木荷幼苗进行代谢物分析,结果发现:共筛选到687个差异代谢物,其中上调的差异代谢物有233个,占比34%;下调的差异代谢物有454个,占比66%。差异代谢物主要富集在ABC转运蛋白通路、花生四烯酸代谢通路、类黄酮生物合成通路、苯丙烷类生物合成通路等。其中,ABC转运蛋白是广泛存在于原核和真核生物中的膜整合蛋白,它利用水解ATP的能量进行细胞膜的主动运输功能[45],涉及到主动向胞外排放种类繁多的内源或外源毒素。主要包括真菌自身产生的侵染寄主植物所需的真菌毒素,土壤环境中有毒重金属元素,其它拮抗微生物所产生的抗生素,化学合成的农药和植物防御性物质。

在各种生理性刺激作用下,细胞膜磷脂被磷脂酶A2脂解释放出花生四烯酸(AA),AA调节多种脂质信号介质的生理反应和病理过程,并控制重要的细胞过程,包括细胞增殖、凋亡、代谢和迁移[46]。法博涛[47]已经证明了其具有促炎症和促细胞凋亡作用,花生四烯酸可以被代谢为促炎性分子和抗炎性分子,萨仁图雅等[48]已经证明花生四烯酸在生物体内含量最丰富,其代谢产物最具有生物活性的小分子物质之一,在众多生理及病理过程中发挥重要的调节作用。

在植物体中类黄酮合成途径是目前研究最为清楚的次生代谢途径,类黄酮物质在植物体内具有重要的生理意义,在植物的授粉、抗病虫害、抵御紫外辐射、与微生物的信号传递等诸多方面发挥重要作用[49-50]。周科等[51]已经证明合成物质具有抗病性的生物合成通路:类黄酮生物合成通路与植物抗逆境胁迫直接相关。

苯丙烷类生物合成途径是植物3条主要次生代谢途径之一,丙氨酸经多步催化反应生成4-香豆酸辅酶A,进入特异性合成途径转化成不同的苯丙烷类代谢产物,如香豆素、类黄酮、萜类、木质素、花青素等,在植物的生长发育过程及应答逆境胁迫中发挥重要作用[52]。这一结果与Wang等[53]的研究结果相似,能量和物质代谢是生物体基本的生命活动现象,这些代谢活动的强弱直接反应着植物的生存情况[54],说明添加抗菌肽有助于提高木荷体内的能量和物质代谢,从而提高木荷体内抗性。

木荷具有树干端直、材质优良、生物防火、蓄水保肥等一系列优良特性,是很好的经济和生态树种。目前,木荷人工林管理粗放,经济效益较差,抗病虫害能力弱,针对木荷病害防治主要局限于其作为病原真菌的毒力因子在侵染寄主植物中的作用方面[55-56],以及植物病原真菌对各类杀菌剂的耐药性问题。综上所述,喷洒抗菌肽对防治木荷病害有显著效果,这将为利用抗菌肽防治木荷病害及持续经营木荷人工林的生产实践提供参考。