非固定状态下椎板重建对兔脊柱稳定性的影响

刘学鹏，孙甲树，张引锋，孙海燕*

1.阳光融和医院骨科，潍坊 261000

2.淄博市第一医院骨科，淄博 255200

脊柱融合术为治疗脊柱疾病不可或缺的方法［1］，但融合手术创伤较大［2］，且易致融合节段活动功能丧失、融合失败、邻近节段退行性变（ASD）等问题［3］。单纯开窗、半椎板切除或椎板切除减压术不影响脊柱稳定性［4］，但5%～ 40%的患者术后发生腰椎不稳甚至滑脱、硬膜外粘连和继发性椎管狭窄等，甚至发生下腰椎术后失败综合征（FBSS）［5］。因此，研究预防椎板切除术后脊柱不稳的材料和手术方法对改善术后效果有积极意义。本研究用自体微小骨粒与不同比例的纳米羟基磷灰石颗粒修复全椎板切除术后的兔椎板缺损，评估其组织相容性及对脊柱稳定性的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取48 只4 月龄新西兰大白兔（山东鲁抗实验动物繁育中心，合格证号：SCXK-2022-0001），雌雄不限，体质量4.5～ 5.5 kg，平均分为4组，每组12只：A 组，自体微小骨粒植骨；B 组，自体微小骨粒与纳米羟基磷灰石以3∶1 的比例混合后进行植骨；C组，自体微小骨粒与纳米羟基磷灰石以1∶1 的比例混合后进行植骨；D 组，空白对照组，仅放置明胶海绵。动物实验方案及实验过程均通过潍坊市阳光融和医院动物实验伦理委员会审核批准。

1.2 实验方法

术前动物禁食水6 h。用1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，取俯卧位，以L5/L6为中心，术野去毛备皮，常规碘伏消毒皮肤，铺无菌洞巾，切开皮肤及浅、深筋膜3～ 4 cm，钝性分离骶棘肌，显露L5棘突及椎板，咬骨钳咬除L5棘突及上下棘突间韧带，1 mm 枪状椎板咬骨钳咬除L5，6节段黄韧带、L5全部椎板，在咬除椎板过程中需要确保关节突关节的关节囊完整性，造成骨缺损平均大小为8 mm×6 mm，全椎板切除动物模型建立完成。

用同一手术切口，牵拉皮缘，暴露其中一侧髂骨，取髂骨（应注意保护走行于髂骨近端下方的腰骶神经，损伤后会出现下肢瘫痪），去除骨膜和软骨，用尖嘴咬骨钳将其咬碎成小骨粒（长宽高均为1～ 2 mm，目测体积与用尖嘴咬骨钳咬碎的纳米羟基磷灰石相仿，尽可能均匀）用作植骨。

选取合适大小明胶海绵捏成薄片状，放入开窗处，在明胶海绵上方放入骨粒，须覆盖椎板缺损处，总量约为3 g（将骨颗粒放在无菌单上，置于微量电子秤上称重）。在植骨前将植骨处（L5，6节段）椎板去皮质化，使其渗血。A 组放入自体微小骨粒；B组自体微小骨粒和纳米羟基磷灰石以3∶1 比例放入；C 组自体微小骨粒和纳米羟基磷灰石以1∶1 比例放入；D 组只放明胶海绵。彻底止血后，留置引流管1 根并妥善固定，逐层缝合切口。术后碘伏消毒，无菌纱布包扎。术后单笼饲养，自由活动、常规喂食给水，观察兔的精神状态、生命体征、双下肢感觉运动功能、二便功能、进饮食、体质量情况等。

术前给予头孢唑啉钠（13 mg/kg）静脉注射1次，椎板切除前30 min 给予静脉注射地塞米松1 mg，术后给予头孢唑啉钠（13 mg/kg）静脉注射2 次（每24 h 1 次）。

1.3 观察指标

术后3 个月每次每组随机空气栓塞法处死4 只动物，取出椎板缺损脊柱标本进行手触检查、生物力学检测及组织切片检查。

每组标本用10%福尔马林液固定1 周，再用10%硝酸脱钙2 周。将1.0 cm 椎板缺损脊柱标本均等分为3 段，分别脱水和石蜡包埋，每段横切片2枚，厚7～ 10 μm，分别行HE 染色，光镜观察植骨区的成骨情况。

取L4～ S1节段标本，去除椎旁肌肉，保留韧带、椎间关节和椎间盘，将标本上、下端用骨水泥进行包埋，置于-20℃冰箱保存。测试时解冻，使用CSS-44100 型材料测试机（实验标准为GB 228-87）轴向加载，在压头上加接测试传感器精确测力，模拟轴向压缩、屈伸、侧曲运动，每个标本每种测试方式重复3 次，取平均值，记录载荷-形变曲线、载荷-位移曲线。同样方法进行标本的强度和轴向刚度检测［6-7］。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0 软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验；以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

A 组1 只动物因术后伤口感染死亡；C 组1 只动物不进食后死亡；均于1 周内补充。一般术后第2 天，所有动物均可进饮食，无精神萎靡、烦躁，双下肢感觉、运动功能正常，二便正常，可站立、行走、摇尾，术后3 d 可跑、跳。术后7 d 切口愈合。术后3个月体质量皆有不同程度增加。

2.1 大体观察

A、B、C 组大体标本新生椎板形态正常，骨质愈合，纤维组织增生连接，骨桥形成，植骨处骨痂愈合良好（图1a～ c）。D 组为纤维结缔组织愈合（图1d）。

图1 大体标本Fig 1 Gross specimen

2.2 组织学观察

A 组可见少量幼稚软骨细胞，较多的成熟软骨陷窝细胞，过渡性骨小梁排列结构趋于正常，向板层骨过渡，骨髓腔贯通，可见大量髓细胞，无炎性反应（图2a）。B 组自体髂骨与人工骨无明显相互促进作用，也无抑制作用；可见较少量的幼稚软骨细胞，以较幼稚的软骨陷窝细胞为主，无过渡性骨小梁，炎性反应基本消失；纤维组织成熟、分化，纳米羟基磷灰石孔隙中细胞长入，未完全降解，晶体数量减少，软骨成骨更多，且趋向成熟骨（图2b）。C 组成骨介于A 组与B 组之间，其新生软骨及成骨较A 组少，较B 组多，较少的幼稚软骨细胞，以成熟的软骨陷窝细胞为主，过渡性骨小梁较少，炎性反应基本消失（图2c）。D 组可见纤维结缔组织增生（图2d）。

图2 HE 染色（×100）Fig 2 HE staining（×100）

2.3 载荷与形变、位移的关系

载荷与形变呈非线性关系，表现出复合组织结构的力学性能。从载荷-应变曲线可发现3 个不同的变化过程：在力量较小时标本即出现形变，类似软组织的力学表现；随着力量的增加，展现出弹性材料的力学表现，表现为弹性形变；最后力量增大而形变减少，曲线斜率明显增大（图3）。载荷与位移基本呈线性关系，载荷-位移曲线基本呈不同斜率的直线（图4）。

图3 载荷与形变关系Fig.3 Relationship between load and deformation

图4 载荷与位移关系Fig.4 Relationship between load and displacement

2.4 植骨段的强度和轴向刚度

生物力学表明，A、B、C 组在植骨段强度及刚度方面差异无统计学意义（P＞ 0.05，表1）；与D 组相比，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，表1）。

表1 120 N载荷下植骨段的强度和轴向刚度Tab.1 Strength and axial stiffness of bone graft segments under 120 N load

3 讨论

理想的植骨材料应具备以下特点［8］。①具备骨传导性，允许骨长入；②具备骨诱导因子，能诱导骨再生和修复；③植骨空隙中存活，且具备干细胞的分化潜能；④结构完整，具备一定的力学支撑特性。自体松质骨内含有丰富的骨髓干细胞、生长因子等［9］，在明胶海绵等特定条件的诱导下可转变为具有成骨活性的细胞［10］，此类细胞在很多动物实验中已被证实具有明确的成骨活性［11］、骨诱导、骨引导、骨传导作用［12］；故自体骨移植一直是植骨融合的金标准［13］。但自体骨来源有限，取骨增加出血量，延长手术时间，部分患者出现髂骨骨折、供骨区疼痛及神经损伤等并发症［14］。同种异体骨虽来源丰富，但因各种弊端限制它只能作为自体骨量不够情况下的一种补充［15］。近年来，随着材料学的不断发展，复合人工骨在植骨术中得到推广［16］。

羟基磷灰石中的钙磷结构接近于人体骨骼，纳米羟基磷灰石具有与松质骨类似的互通的多孔支架结构，无抗原性，具有生物相容性［17］，其力学性能可满足临床上骨组织修复的要求［18］，其化学成分和表面特性可影响细胞的生存、附着、迁移分化和增殖［19］。骨移植后骨愈合的3个基本过程是移植物的血管化、新生骨形成及与邻近骨质融合［20］，血管化是关键环节，血管化程度与植骨修复效果呈正相关［17］。羟基磷灰石可在缺损处为修复早期的微血管形成及宿主骨细胞的附着提供支撑［14］。有研究［21］应用纳米羟基磷灰石修复兔的桡骨缺损，可见植入材料内大量新生血管组织长入，并存在随血液循环进入的间充质干细胞等在诱导因子的作用下分化为成骨细胞，并能产生新生骨组织加速骨愈合。本研究的组织学检查也有相同发现，如新生血管长入及软骨细胞生长，术后3 个月周围纤维组织、软骨组织与纳米羟基磷灰石融合，且没有明显的排斥反应。

本研究还发现，随着自体骨比例的降低，融合的成功率及生物力学指标也均有下降，并且炎性介质增加。也有研究［22］报道，单独应用纳米羟基磷灰石进行植骨，2、4、6、10 周时均未观察到骨融合，组织学观察成骨效果亦不如自体骨，说明纳米羟基磷灰石材料本身虽具有仿生骨的构架，有骨传导性，但其成骨效果欠佳；其作用机制是诱导干细胞长入，促进细胞因子附着和增生，逐渐分化为新生骨组织，同时，纳米羟基磷灰石逐渐分解，最终被新生骨组织替代［23］。且本研究未采取制动措施，植骨颗粒与植骨床之间可能存在微动，也可能影响植骨融合的效果。但Nagel 等［24］在羊后路椎板融合研究中发现，腰椎关节的融合率为100%，而腰骶关节的融合率为0，L5/L6节段平均位移1.2 mm，产生10%应变，认为椎板间轻微位移不会对植骨融合产生影响。Evans［25］认为，理想的植骨区力学环境应遵循：①作用于植骨块和宿主骨的载荷不能超过两者所能承受的最大载荷；②植骨区应受到适当的应力刺激，可以存在微动关系，但不能有显著运动，且愈合前不应存在张应力。本研究术后3 个月植骨组均愈合良好，因此，推测植骨愈合不仅需要一定的植骨环境，也需要一定的应力刺激。

有研究［26-28］表明，后方韧带复合体（PLC）对脊柱有显著的稳定作用，可以限制脊柱的过度屈伸。本研究结果显示，与未植骨组（D 组）相比，植骨组（A、B、C 组）的屈伸、压缩、拉伸应力均较高，表明椎板重建能增加脊柱的稳定性；也从另一个方面说明，椎板切除对腰椎PLC 的生物力学影响较大，这与Kim 等［29］的研究结果一致。分析其原因，椎板重建恢复了腰椎的后张力带，并重建了腰椎PLC 结构，其中椎板可抵抗轴向旋转，后侧张力带可抵抗屈曲运动。Merter 等［30］的研究表明，FBSS 的发生可能是由于PLC受损后脊柱后部结构失去了对压缩力的阻力，大部分压缩力转移到椎间盘。Li 等［31］的研究表明，保留PLC 可减少减压节段的椎间盘应力。Huang 等［32］发现，在后路腰椎椎间融合术中保留PLC 可有效预防ASD 的发生。此外，另一项研究［33］也发现，椎板切除术本身也会导致ASD。因此，结合本研究的生物力学数据可以推断，椎板重建可以通过恢复脊柱后部结构来预防ASD，减轻减压节段的椎间盘应力［17］。相关研究［34］还表明，椎板切除术后椎板重建对关节活动度的影响较小，说明重建椎板不仅可以重建脊柱的稳定性，还可保留脊柱小关节的原始关节活动度。

本研究结果表明，全椎板切除术后行椎板重建可增加脊柱稳定性，且新生椎板的生物学特性不仅符合椎板的力学需求，还有很好的生物相容性及骨诱导性，具有广泛的应用前景。但本研究样本量较小，实验时间短，动物模型力学性能与人体存在差异，且缺乏在临床实践中的验证，结论仍需进一步探讨、研究。