成纤维细胞生长因子2在椎间盘退行性变中的作用及机制

李 磊 ，王一范2，施强慧，钟华建

1.温州医科大学附属衢州医院（衢州市人民医院）骨科，衢州 324000

2.海军军医大学长征医院健康管理科，上海 200003

3.中国人民解放军63680 部队医院骨科，江阴 214400

4.海军军医大学长征医院骨科，上海 200003

椎间盘是相邻椎体之间的软骨组织，由中央髓核、外围纤维环及上下两端软骨终板构成，在维持脊柱稳定性、缓冲生物应力中发挥重要作用，当椎间盘发生退行性变时，其内在弹性丧失，易在急性应力作用下发生纤维环破裂、髓核突出、椎间高度丢失，导致颈腰痛等临床症状［1］。目前，临床针对椎间盘退行性变（IDD）相关疾病（如颈椎病、腰椎椎间盘突出、椎管狭窄等）的治疗主要包括非手术治疗（功能锻炼、热疗、物理治疗，口服解热镇痛药、局部神经阻滞等）和手术治疗（椎间盘切除融合术、人工椎间盘置换术、椎板切除植骨融合术、椎管扩大椎板成形术等），部分患者症状可获得有效缓解，但易复发［2-3］，究其原因是IDD 发生机制尚不明确，现有治疗手段均不能从发生机制着手，无法延缓甚至逆转退行性变进程。

IDD 主要表现为髓核细胞凋亡、细胞外基质（ECM）代谢紊乱（合成减少、分解增加）、炎性反应、神经和血管长入椎间盘等病理过程，其中以ECM代谢紊乱最为重要［4］。椎间盘ECM主要包含蛋白聚糖（主要是糖胺聚糖）和Ⅱ型胶原，椎间盘发生退行性变时，糖胺聚糖和Ⅱ型胶原表达显著减少，导致椎间盘ECM减少、含水量丢失［5］。多项研究［6-7］表明，Wnt/β-catenin信号通路可诱导髓核细胞凋亡及ECM降解，进而加速IDD 进程。成纤维细胞生长因子2（FGF2）对ECM代谢具有重要影响，Meo Burt等［8］在FGF2过表达的小鼠软骨组织中发现Wnt/β-catenin信号通路显著激活，说明FGF2 对该通路具有调控作用，而这种调控作用是否同样存在于椎间盘组织尚未可知。因此，本研究拟探索FGF2在IDD中的功能及对Wnt/β-catenin信号通路活性的影响，旨在为阐明IDD关键致病因子及调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

FGF2 抗 体（ab92337）、ACAN 抗 体（ab3778）、MMP3 抗体（ab52915）、ADAMTS-4 抗体（ab185722）均购自Abcam 公司，active β-catenin 抗 体（05-665）购自Millipore 公司，phospho-β-catenin 抗体（2009）、β-catenin 抗体（8480）购自Cell Signaling Technology公司，cleaved-caspase3（ab32042）、BAX（ab32503）、Bcl2（182858）购自Abcam 公司；促炎因子白细胞介素-1β（IL-1β）购自Peprotech公司，FGF2重组蛋白（3718-FB）购自R&D公司，Wnt/β-catenin信号通路抑制剂PRI-724购自Selleck公司；TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒（RR820A）及反转录试剂盒（RR047A）购自TaKaRa 公司。GeneAmp 9700 型荧光定量PCR 仪为Applied Biosystems 公 司产品。ELISA 检测试剂盒（ERA4RB）购自Thermo Fisher 公司，干扰RNA 均购自吉玛基因。

1.2 小鼠组织标本获取及处理

6 月龄和24 月龄小鼠各10 只，购自海军军医大学实验动物中心［动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0002］。将6 月龄小鼠椎间盘设定为正常椎间盘，将24 月龄小鼠椎间盘设定为老年退行性变椎间盘。采用CO2吸入法处死小鼠，而后沿背部正中线剪开皮肤及皮下软组织，分离肌肉后离断腰椎部分，剔除腰椎周边肌肉，取出椎间盘组织。部分标本置于4%多聚甲醛中固定24～ 36 h，按常规方法脱钙、石蜡包埋、切片，进行HE 染色、Masson染色和番红固绿染色，评估IDD 情况。对切片进行免疫组织化学染色，观察FGF2 的表达情况。剩余标本冻于液氮中，用于蛋白质印迹法检测FGF2 表达水平。

1.3 髓核细胞培养及处理

根据Risbud 等［9］的方法提取髓核细胞，从140～ 160 g Sprague-Dawley 大鼠［20 只，购自海军军医大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0002）］髓核组织中分离原代髓核细胞，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基制备细胞悬液后置于37℃、5% CO2细胞培养箱中静置72 h，观察细胞贴壁情况并更换细胞培养基，之后每3 d更换一次培养基，待细胞生长至约80%汇合时进行传代或冻存，取2～ 4 代的髓核细胞进行实验。①收集大鼠髓核细胞，分别采用0、10、25、50 ng/mL促炎因子IL-1β 刺激诱导细胞退行性变，通过蛋白质印迹法和ELISA 分别检测FGF2 在细胞内表达及分泌至细胞外的含量。②采用0、5、10、50 ng/mL FGF2 重组蛋白刺激正常髓核细胞，采用0、0.5、1.0、5.0 μg/mL FGF2中和抗体干预经25 ng/mL IL-1β预处理的退行性变髓核细胞，采用FGF2 干扰RNA（siFGF2，25 pmol）和阴性对照（siNC，25 pmol）转染经25 ng/mL IL-1β 预处理的退行性变髓核细胞，通过流式细胞术及TUNEL 染色检测髓核细胞凋亡情况，通过蛋白质印迹法检测髓核细胞内凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3、BAX、Bcl2）和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（active β-catenin、β-catenin、磷酸化β-catenin）的表达水平，通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ECM 代谢相关基因（ACAN、COL2A1、MMP3、MMP13、ADAMTS-4、ADAMTS-5）的表达水平。③采用Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂（PRI-724）处理FGF2 重组蛋白刺激后的大鼠髓核细胞，通过流式细胞术和TUNEL 检测髓核细胞凋亡情况，通过蛋白质印迹法检测髓核细胞内凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3、BAX、Bcl2）表达水平，通过实时荧光定量PCR 和蛋白质印迹法检测ECM代谢相关基因（ACAN、COL2A1、MMP3、MMP13、ADAMTS-4、ADAMTS-5）的表达水平。

1.4 统计学处理

采用Graphpad 9.0 软件对数据进行统计分析。各组数据采用D’Agostino-Pearson omnibus normality和Shapiro-Wilk normality 检验进行正态性分析，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用Studentt检验，多组间比较采用单因素方差分析；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FGF2在椎间盘退行性变时表达水平上调

小鼠椎间盘组织病理学染色结果显示，相较于6 月龄小鼠，24 月龄小鼠椎间盘内类圆形髓核细胞数目显著减少，分布散在稀疏，ECM 中胶原纤维排列紊乱，蛋白聚糖含量显著降低，符合IDD 组织学变化（图1a）。免疫组织化学检测结果显示，发生退行性变的椎间盘内FGF2 阳性的髓核细胞比例显著高于正常椎间盘（P＜ 0.05，图1b、c）；蛋白质印迹法检测结果显示，发生退行性变的椎间盘内FGF2蛋白含量显著高于正常椎间盘（P＜ 0.05，图1d）。以上结果从组织学层面说明FGF2 在IDD 时表达增加。

图1 IDD 时FGF2 表达变化Fig.1 Expression of FGF2 during IDD

为进一步验证IDD 对FGF2 表达的影响，收集大鼠髓核细胞，采用不同浓度促炎因子IL-1β 刺激诱导细胞发生退行性变，通过蛋白质印迹法和ELISA 分别检测FGF2 在细胞内表达及分泌至细胞外的含量，结果显示，FGF2在促炎因子IL-1β诱导发生退行性变的髓核细胞内表达及分泌水平显著上调，其峰值出现在IL-1β浓度为25 ng/mL时（图1e、f）。因此，将25 ng/mL 定为IL-1β 最适作用浓度用于后续实验。

2.2 FGF2促进髓核细胞凋亡

流式细胞术、TUNEL 和蛋白质印迹法检测结果显示，FGF2 重组蛋白显著促进正常大鼠髓核细胞凋亡，增加正常大鼠髓核细胞内凋亡相关蛋白（cleaved-caspase3、BAX、Bcl2）表达水平（图2a～ f）；采用FGF2 中和抗体或siFGF2 干预IL-1β 预处理的退行性变髓核细胞，细胞凋亡比例及凋亡相关蛋白均显著下调（图2g～ r）。上述结果提示FGF2 能促进髓核细胞凋亡发生。

图2 FGF2对大鼠髓核细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of FGF2 on nucleus pulposus cell apoptosis

2.3 FGF2促进髓核细胞ECM 代谢紊乱

实时荧光定量PCR 和蛋白质印迹法检测结果显示，FGF2 重组蛋白显著减少正常髓核细胞内ECM 合成相关基因（ACAN、COL2A1）表达，增加ECM 分解相关基因（MMP3、MMP13、ADAMTS-4、ADAMTS-5）表达，而FGF2 中和抗体或siFGF2 对退行性变髓核细胞的作用趋势与之相反（图3）。以上结果说明FGF2 对髓核细胞ECM 代谢具有抑制合成、促进分解的作用。

图3 FGF2对大鼠髓核细胞ECM 代谢的影响Fig.3 Effect of FGF2 on ECM metabolism of rat nucleus pulposus cells

2.4 FGF2 通过Wnt/β-catenin 信号通路调控髓核细胞退变

蛋白质印迹法检测结果显示，active β-catenin在FGF2 重组蛋白刺激后表达水平显著升高，而FGF2中和抗体或siFGF2可显著降低IL-1β刺激所上调的active β-catenin 水平；此外，phospho-β-catenin表达趋势与active β-catenin相反，总体β-catenin水平变化不明显（图4a、b）。以上结果说明，Wnt/β-catenin信号通路在IDD 时显著激活，而这种激活作用可能与FGF2表达升高有关。

图4 Wnt/β-catenin信号通路在FGF2调控IDD 中的作用Fig.4 Effect of Wnt/β-catenin signaling pathway on FGF2 regulating IDD

为明确Wnt/β-catenin 信号通路在FGF2 调 控IDD 中的作用，在FGF2 重组蛋白刺激髓核细胞基础上添加Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂（PRI-724），流式细胞术、TUNEL 染色、蛋白质印迹法及实时荧光定量PCR 检测结果显示，在PRI-724 作用下，FGF2对髓核细胞引发的促凋亡作用减轻，而FGF2导致的髓核细胞ECM合成减少、降解增加等代谢异常也有所恢复（图4c～ j）。以上结果说明Wnt/β-catenin信号通路是介导FGF2调控髓核细胞凋亡和ECM代谢紊乱的重要环节，提示FGF2可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控IDD。

3 讨论

本研究基于大鼠原代髓核细胞开展细胞及分子实验，通过促炎因子IL-1β 诱导髓核细胞退行性变构建IDD 细胞模型，结果发现，髓核细胞发生退行性变时FGF2 表达水平显著上调，并且FGF2 能显著促进髓核细胞凋亡，促进ECM 降解代谢、抑制ECM 合成代谢。FGF2 也称碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），是FGF家族的重要成员。人类共有22种FGF蛋白，根据分泌形式分为自分泌、旁分泌和内分泌三大类，其中FGF2通过旁分泌形式发挥作用［10］。FGF2 在人体多处组织器官中表达，参与多种疾病的发生、发展。20 世纪90 年代有学者针对FGF2 在IDD 中的作用进行研究。Thompson 等［11］基于犬组织培养的研究发现，FGF2 促进髓核ECM 成分蛋白聚糖合成；Nagano 等［12］报道FGF2促进大鼠髓核细胞增殖，提示FGF2 对椎间盘具有保护作用。然而，部分学者在髓核细胞及关节软骨细胞中发现FGF2抑制ECM 合成代谢，促进分解代谢［13-16］，与本研究结果一致。值得注意的是，IDD的病理表现多样，仅评估FGF2 对髓核ECM 代谢影响无法明确FGF2 对IDD 的作用。因此，本研究针对FGF2 调控髓核细胞凋亡及ECM 代谢展开探索，发现FGF2 显著促进髓核细胞凋亡及ECM 降解代谢，抑制ECM 合成代谢，并由此从细胞层面提出FGF2促进IDD。

2018 年，Meo Burt 等［8］构建基因过表达小鼠，发现FGF2 过表达促进小鼠骨关节炎发生，伴随软骨组织中Wnt/β-catenin 信号通路激活；此外，该信号通路抑制剂显著缓解FGF2 过表达诱导的骨关节炎表型，提示FGF2 正向调控Wnt/β-catenin 信号通路，后者在FGF2 影响骨关节炎中发挥关键作用。Wnt/β-catenin 是生物进化中高度保守的信号通路，参与胚胎发育和组织稳态维持。Wnt/β-catenin 信号通路包括细胞膜Wnt 信号转导、细胞质β-catenin 信号稳定及细胞核靶基因转录调控3 部分，当Wnt 未被激活时，细胞质内的β-catenin 蛋白易被支架蛋白Axin、结肠腺瘤息肉易感蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3（GSK-3）及酪蛋白激酶1（CK1）组成的蛋白降解复合体磷酸化后降解；而Wnt 激活可抑制β-catenin 蛋白磷酸化，未被磷酸化的β-catenin 蛋白在细胞质中稳定存在，并逐步向细胞核内移位，与转录因子T 细胞因子/淋巴样增强因子结合，调控靶基因转录［17］。Wnt/β-catenin 信号异常与人体多种疾病息息相关，目前认为其对椎间盘的作用主要是通过刺激髓核细胞凋亡，影响ECM 代谢平衡等诱导IDD［7］。此外，Xu 等［18］发现Wnt/β-catenin 信号对终板软骨细胞的退行性变具有促进作用；Hao 等［19］在动物体内发现Wnt/β-catenin 信号抑制可缓解椎间盘发生退行性变表现，延缓退行性变进程；说明Wnt/β-catenin 信号对IDD 具有重要影响。本研究发现，Wnt/β-catenin信号在介导FGF2调控髓核细胞凋亡及ECM 代谢紊乱中发挥重要作用，如前所述，位于细胞膜的Wnt 主要负责细胞内外的信号转导，而FGF2 蛋白作为FGF 家族旁分泌亚类中一员，通常经由细胞膜FGF 受体实现信号转导，Wnt 和FGF 受体是否存在相互关联尚未见文献报道。本课题组将在后续研究中对FGF2 调控髓核细胞及IDD 所涉及的细胞信号转导机制深入探索。

综上所述，本研究通过动物和细胞实验发现，发生IDD 的髓核细胞FGF2 表达水平升高，通过Wnt/β-catenin信号通路诱导髓核细胞凋亡及ECM代谢紊乱，从而加剧IDD进程，揭示了FGF2在椎间盘中的促退行性变作用及调控机制，为阐明IDD 发生机制提供了理论依据。