陆生蓝藻地木耳中海藻糖提取工艺研究

2024-01-01徐曼龚军吴超广

智慧农业导刊 2024年5期

摘" 要：该研究从三氯乙酸浓度、三氯乙酸用量、提取温度及时间4个方面初步探讨从地木耳中提取海藻糖的工艺，该研究通过单因素和正交试验，优化从地木耳中提取海藻糖的工艺条件，通过考察三氯乙酸浓度、用量、提取温度和时间对提取率的影响，确定最佳工艺条件。最佳工艺条件为0.3 M三氯乙酸浓度，用量5 mL，提取温度80 ℃，时间50 min。

关键词：地木耳；海藻糖；三氯乙酸；正交试验；提取工艺

中图分类号：Q946" " " " 文献标志码：A" " " " " 文章编号：2096-9902（2024）05-0033-05

Abstract： In this study， the technology of extracting trehalose from Auricularia auricula was discussed from four aspects： the concentration of trichloroacetic acid， the amount of trichloroacetic acid， extraction temperature and time. The technological conditions of trehalose extraction from Auricularia auricula were optimized by single factor and orthogonal experiments. The optimum conditions were determined by investigating the effects of trichloroacetic acid concentration， dosage， extraction temperature and time on the extraction rate. The optimum conditions are as follows concentration of 0.3 M trichloroacetic acid， dosage of 5 mL， extraction temperature of 80 ℃ and time of 50 min.

Keywords： Auricularia auricula; trehalose; trichloroacetic acid; orthogonal test; extraction technology

自然界中存在着一种特殊的分子，被称为海藻糖。海藻糖是一种非还原性双糖，由2个葡萄糖分子通过α-1，1-键连接而成，在低等动植物、藻类、真菌及细菌中广泛分布。海藻糖作为一种特殊的非还原性双糖，能够在各种恶劣环境下保护细胞内的生物大分子，因此在食品保鲜、药物制剂保护等领域拥有广泛的应用前景和重要意义。2004年，研究人员通过薄层层析法首先在地木耳中检测到了海藻糖的存在，这为海藻糖的来源提供了新的视角。除地木耳外，红藻等其他材料中也检测到了海藻糖的存在，这为从多种来源开发海藻糖提供了可能。基于此，开发利用地木耳中海藻糖的资源具有重要的科研和实际意义。

关于海藻糖的提取工艺研究，研究人员针对其技术的多样性和复杂性，主要集中在绿球藻、葡萄酒泥酵母、面包酵母和啤酒酵母细胞等不同生物材料的提取方法研究。研究显示，通过热水浸提法、醇提法等多种工艺可以有效提取海藻糖，且通过优化提取条件可以提高海藻糖的得率和纯度。此外，研究人员还探讨了海藻糖在食品保鲜、提高酵母耐受性等方面的应用，突显了其在食品工业和医药领域的重要价值。研究人员还进行了对海藻糖提取液的进一步处理和纯化方法研究，如使用超滤、纳滤等膜分离技术，以及探索了海藻糖的新应用，如在液体发酵中的使用。这些研究不仅为海藻糖的工业生产提供了技术支持，也为其未来的应用开发提供了理论基础。

本研究通过单因素试验初步考察各影响因素对提取率的影响，再运用正交试验对主要因素进行优化，确定了综合考虑提取效率及操作的最佳提取工艺方案。本研究为充分开发利用地木耳中海藻糖资源提供了科学参考。

1" 材料与仪器

1.1" 实验材料

地木耳：市售。

1.2" 实验试剂

本实验所用三氯乙酸由天津市北方天医化学试剂厂提供，蒽酮产品产自北京化工厂，而海藻糖标准品则由Sigma公司提供。

1.3" 实验仪器

本实验中使用的仪器包括：天津市华伟科技发展有限公司生产的分光光度计7230G，长沙湘仪离心机仪器有限公司制造的离心机L-550，梅特勒-托利多常州衡器有限公司的电子精密天平JB5374-91，以及天津市中环实验电炉有限公司提供的恒温水浴锅TDA-8002和电热鼓风干燥箱DH-101。

2" 实验方法

2.1" 海藻糖含量的测定

本工艺采用蒽酮-硫酸法进行试验。在本研究中，首先对已知量的碳水化合物样品进行定量取样。将该样品准确地移入试管或适当的反应容器内。随后，依据样品的质量，向其中滴加预定浓度的蒽酮溶液。接着，以控制的速率缓慢加入浓缩硫酸，同时确保反应体系均匀混合，以促进反应完全进行。将反应体系置于恒温水浴中，在90 °C的条件下进行加热，以完成化学反应并生成充分的紫色产物。加热过程完成后，允许反应混合物在室温下冷却至平衡状态。随后，采用分光光度计，在540 nm的特定波长处测定紫色产物的吸光度值。为了建立碳水化合物含量的定量分析方法，利用不同浓度的海藻糖标准品制备标准溶液，测定其在540 nm处的吸光度，并据此绘制出标准吸光度曲线。

2.2" 海藻糖标准曲线的绘制

采用精密电子天平准确称取0.25 g海藻糖，并在500 mL容量瓶中稀释至刻度，充分摇匀以确保溶液均一。此溶液作为海藻糖的标准母液。依据表1的指示，准确抽取不同体积的海藻糖母液置入带有5.0 mL0.5 mol/mL三氯乙酸的50 mL容量瓶中，并补充至标线以配制不同浓度的海藻糖标准溶液。

将1 mL的样品及空白对照（后者包括5.0 mL 0.5 mol/mL三氯乙酸溶解于50 mL蒸馏水中）分别转移至预先烘干并清洁的试管中。随后加入5 mL已配制的硫酸-蒽酮溶液，充分振荡以混匀。将试管置于沸水浴中精确反应10 min，之后立即冷却至室温。最终，利用分光光度计在特定波长下测定吸光度，并以此作为纵轴数据，绘制海藻糖的标准吸光度曲线。标准曲线将用于计算待测样品中碳水化合物的浓度，根据其吸光度值。通过海藻糖标样绘制海藻糖标准曲线，如图1所示，得出线性回归方程。

2.3" 单因素试验

2.3.1" 材料的预处理

取10 g地木耳单层平铺于托盘中，置于90 ℃的干燥箱中处理20～24 h，使地木耳中的水分完全蒸发，呈现干枯易碎的状态，然后在研钵中将烘干的地木耳研磨成粉待用。

2.3.2" 三氯乙酸（TCA）提取海藻糖

向烧杯中准确称取0.1 g地木耳粉末，加入5.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液。震荡混匀后，烧杯置于50 ℃水浴中加热，每隔5 min振荡一次，持续20 min。随后在3 500～4 000 r/min下离心5 min，轻心倒出上清液至预先准备好的、含有冰水的50 mL容量瓶中。使用冰水对烧杯内残留的地木耳粉末再次洗涤并离心2次，合并所有上清液至50 mL容量瓶，并加冰水至刻度线，摇匀混合。取1 mL所得试液，与蒽酮硫酸溶液混合后，在沸水浴中反应，最后在590 nm处测定吸光度。

2.4" 正交试验

在地木耳多糖的提取过程中，三氯乙酸的浓度、用量、提取温度以及提取时间等参数对提取效率具有显著影响。为了优化提取条件，本研究采用L9（3×4）的正交试验设计来评估这些因素。基于之前单因素实验的结果，为每个影响因素设定了3个不同的水平，具体水平设置见表2。

3" 结果与分析

3.1" 三氯乙酸浓度对海藻糖提取效率的影响

为评估三氯乙酸浓度对海藻糖提取效率的影响，本实验设计采用了不同浓度的三氯乙酸作为提取溶剂，具体浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.8和1.0 M。在所有实验中，固定使用10 mL三氯乙酸，设定提取时间为40 min，并在40 ℃条件下进行提取。随后测定各实验条件下提取液中海藻糖的含量，以此考察三氯乙酸浓度对提取效率的具体影响。结果详细记录于表3。

由表3可知，三氯乙酸浓度对海藻糖提取量有显著影响。当三氯乙酸浓度为0.3 M时，海藻糖的提取含量达到最高，为32.56 mg/g。随着三氯乙酸浓度的进一步增加到0.5 M，海藻糖含量略有下降至31.03 mg/g。在0.8 M时，海藻糖含量减少到30.21 mg/g，而在三氯乙酸浓度为1 M时，海藻糖含量进一步降至28.55 mg/g，为5个浓度水平中最低。这表明在本实验条件下，三氯乙酸浓度过高或过低都会对海藻糖的提取效率产生不利影响，而0.3 M是最适宜的三氯乙酸浓度，能够最大限度地提取海藻糖。

3.2" 三氯乙酸用量对海藻糖提取效率的影响

在固定的提取条件下，即温度设定为40 ℃，三氯乙酸浓度为0.3 M，提取时间为40 min，本实验采用了不同体积的三氯乙酸作为提取溶剂，分别为5、10、15、20、25 mL。通过测定这些不同体积的提取溶液中海藻糖的含量，本研究评估了三氯乙酸用量对海藻糖提取效率的影响，结果见表4。

由表4可知，海藻糖的提取量随三氯乙酸的使用量呈现出一定的变化趋势。当三氯乙酸用量为10 mL时，提取得到的海藻糖含量最高，为34.02 mg/g，这表明在本实验条件下，10 mL是最优的三氯乙酸用量。而在使用5 mL三氯乙酸时，海藻糖的含量也相对较高，为32.32 mg/g。随着三氯乙酸用量的增加至15、20、25 mL，海藻糖含量出现了下降，分别为30.66、31.32、30.64 mg/g。这可能表明较高体积的三氯乙酸并未进一步提高海藻糖的提取效率，反而可能因为溶剂量的增加而稀释了提取物中的海藻糖浓度。综合考虑，10 mL三氯乙酸用量在本实验条件下最有利于海藻糖的提取，而过量的三氯乙酸使用对提取效率并无益处，甚至可能对海藻糖含量产生负面影响。

3.3" 提取温度对海藻糖提取效率的影响

在一系列恒定的实验条件下，即三氯乙酸的体积为10 mL，浓度为0.3 M，提取时间为40 min。本研究探讨了不同提取温度（30、40、50、60、70和80 ℃）对海藻糖提取效率的影响。通过测定在上述各温度条件下得到的提取液中海藻糖的含量，旨在确定最佳的提取温度，结果见表5。

从表5可以看出，提取温度对海藻糖提取量有显著的影响。随着提取温度的升高，海藻糖提取量呈现先增加后减少的趋势，在40 °C时达到第一个峰值3 5.32 mg/g。之后提取量有所下降，在50～70 °C维持在31～32 mg/g左右的水平。当提取温度继续提高到80°C时，提取量再次显著提高，达到38.21 mg/g。结果表明，适宜的提取温度可以促进海藻糖的溶出，提高提取效率。但是，过低或过高的温度则不利于海藻糖的提取。40 °C和80 °C是2个最佳的提取温度。

3.4" 提取时间对海藻糖提取的影响

在三氯乙酸体积为10 mL、浓度0.3 M、提取温度40 ℃条件下，分别提取20、30、40、50、60和70 min测定提取液中海藻糖的含量，考察提取时间对海藻糖提取的影响，结果见表6。

由表6可知，在其他提取条件固定的情况下，提取时间的延长也影响了海藻糖的提取效果。当提取时间在20～40 min间延长时，海藻糖的提取量持续增加，在40 min时达到峰值34.28 mg/g。但提取时间继续延长到50 min以上时，海藻糖的提取量则开始下降，在70 min时减少到28.76 mg/g。这表明在一定范围内，提取时间的增加有利于海藻糖的充分溶出，但过长的提取时间会导致已经溶出的海藻糖发生降解，从而使得提取率下降。40 min是提取时间的最佳选择。

综合以上各个单因素实验可得海藻糖提取的最优条件：三氯乙酸浓度0.3 M，三氯乙酸用量10 mL，提取温度80 ℃，提取时间40 min。

3.5" 正交试验综合分析

采用三氯乙酸浓度、三氯乙酸用量、提取温度和提取时间4个因素进行正交试验，通过对海藻糖含量的测定来确定各因素的最优水平。正交试验的直观分析结果见表7。

通过正交实验优化提取工艺参数的直观分析结果显示，4个考察因素对海藻糖提取率的影响大小顺序：三氯乙酸浓度、提取温度、三氯乙酸用量、提取时间。其中，三氯乙酸浓度的影响最为显著，其极差值最大，且0.3 M浓度级别对应的平均提取量较高。提取温度的影响次之，80 °C提取量较优。三氯乙酸用量和提取时间的影响相对较小。综合各因素水平的提取效果，确定最佳工艺参数组合为A2B1C2D3，即三氯乙酸浓度0.3 M、用量5 mL、温度80 ℃、时间50 min。

4" 结论

本研究以地木耳为原材料，采取三氯乙酸提取法，通过单因素试验和正交试验这2种实验优化设计方法，系统地优化了地木耳中海藻糖的提取工艺条件。结果表明，三氯乙酸提取液的浓度是影响海藻糖提取效率的主要因素，其最佳浓度水平为0.3 M。提取温度对提取效果也有重要影响，80 °C为较优温度水平。三氯乙酸溶液的用量以10 mL为宜，提取时间以40 min为最佳。正交试验结果进一步验证，考虑提取效率及操作便捷性，确定最优的参数组合为三氯乙酸浓度0.3 M、用量5 mL、温度80 °C、时间50 min。

本研究初步建立和优化了地木耳中海藻糖的提取方法，为后续大规模开发利用这一重要资源提供了科学依据。在今后的研究中，还需继续改进提取工艺以提高产率，并开展地木耳中海藻糖的功能及应用方面的研究，为相关产业的发展提供支持。

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