植物精油纳米乳液对魔芋毛肚保鲜研究

◎ 杜丹丹，苏馨莲，王兆明,，周 辉,

（1.蒙城绿色食品产业研究院，安徽 蒙城 233500；2.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009）

魔芋葡甘聚糖（Konjac Glucomannan，KGM）是从魔芋中提取的一种中性多糖，其具有良好的保水性、流变性、增稠性和胶凝性，被广泛应用于食品、生物医学、工业、农业等领域[1]。魔芋葡甘聚糖可作为制作仿生食品的原料，如魔芋素毛肚、素虾仁等。由于魔芋葡甘聚糖具有降低血糖水平、抗肥胖、抗癌、抗胆固醇、提高免疫力和改善便秘等功效，魔芋产品在市场上备受消费者的喜爱[2-3]。然而，魔芋产品货架期短，需相关人员进一步研究魔芋制品易感腐败微生物，开发绿色防腐技术，以延长其产品货架期。

丁香、大蒜、肉桂在食品工业中作为调味剂被广泛使用，丁香、大蒜、肉桂精油均具有较好的抗菌活性[4]。SUSANA 等[5]发现，在沙拉酱中使用丁香精油纳米乳液可以抑制酵母菌的生长繁殖。SAGAR等[6]比较了涂有丁香纳米乳液和未涂精油纳米乳液的鸡爪，观察到涂有丁香纳米乳液的鸡爪保质期更长，且纳米乳液在较长时间内保持了产品的质量和感官属性。大蒜精油可抑制腐乳中蜡样芽孢杆菌的生长，在天然定向防腐剂方面具有很大的潜力[7]。研究表明，肉桂精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等致病菌具有较强的抑菌性[8]，使用肉桂精油作为活性剂的纳米乳液，对不同微生物表现出了优异的抗菌性能[9-10]。PUNCHARAT 等[9]研究发现，与丁香精油相比，丁香精油纳米乳液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌表现出更好的抗菌活性。

本试验以玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠和植物精油（肉桂精油、大蒜精油、丁香精油）为基本成分，制备精油纳米乳液，并将其应用于魔芋素毛肚保鲜，再通过菌落总数、乳液表征等指标，评价植物精油纳米乳液对魔芋素毛肚的保鲜效果，以筛选出抑菌效果最佳的纳米乳液，为魔芋制品的综合利用与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

魔芋胶（成都晗晨生物科技有限公司）；柠檬酸（浙江一诺生物工程有限公司）；乙酰化双淀粉己二酸酯（河南万邦化工科技有限公司）；氢氧化钙（江西明源高新技术材料有限公司）；玉米蛋白、大豆分离蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；肉桂精油、大蒜精油、丁香精油（仲景食品有限公司）；PCA 培养基、CFC 培养基、不动杆菌培养基、孟加拉红培养基（青岛海博生物技术有限公司）。

1.2 仪器设备

高剪切乳化均质机（上海三申医疗器械有限公司）；全自动旋蒸仪（郑州长城科工贸有限公司）；离心机（安徽宝莱科技有限公司）；HH 数显恒温水浴锅（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；真空包装机（安盛科技有限公司）。

1.3 样品制备

1.3.1 魔芋样品制备

将9 g 淀粉与10.5 g 魔芋粉混匀，再加入300 mL 蒸馏水，在60 ℃下水浴糊化30 min，再加入1% Ca(OH)2溶液50 mL，高速搅打混匀，在90 ℃下水浴蒸煮2 h，使用400 mL 2%柠檬酸溶液脱碱30 min，漂洗之后，加入适量香辛料（食用油、盐、五香粉和辣椒粉），搅拌均匀，真空包装备用。

1.3.2 植物精油纳米乳液制备

本研究参考HUA 的方法[11]，用玉米醇溶蛋白和75%乙醇配制成20 mg·mL-1的玉米醇溶蛋白溶液，磁性搅拌器搅拌过夜；用酪蛋白酸钠和纯水配制成4 mg·mL-1的酪蛋白酸钠，磁性搅拌器搅拌过夜。磁性搅拌器搅拌酪蛋白酸钠的同时，用移液枪将20 mg·mL-1的玉米醇溶蛋白溶液按1∶10 的比例逐滴滴入4 mg·mL-1的酪蛋白酸钠溶液，继续磁性搅拌30 min。将混合液倒入旋转式蒸发器中进行乙醇蒸发，水浴温度40 ℃，转速20 r·min-1，蒸发至液体基本上无气泡。为防止液体倒流现象，乙醇蒸发过程中需要加入一些气体。蒸发完成后，倒入量筒中，加纯水至蒸发前混合液体积，4 ℃冰箱中保存备用。向上述溶液中分别加入1% v/v 肉桂、丁香、大蒜精油，以15 000 r·min-1的速度在均质机中均质3 min（每均匀40 s，停止20 s）。

1.4 腐败菌鉴定和分离

参考江杨阳[12]的方法略作修改。将5 g 样品混合在45 g 无菌生理盐水中，均质，将1 mL 样品液加入装有9 mL 无菌生理盐水试管中，适量稀释。取3 种相邻浓度梯度（10-4、10-5、10-6）的样品液各0.1 mL涂敷在PCA（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）培养基、孟加拉红培养基（全部真菌）、CFC 培养基（假单胞菌）和不动杆菌培养基（不动杆菌）等平板上封口膜密封培后，放到适宜温度的恒温培养箱中培养1～2 d，通过各培养基上菌落生长情况及菌落总数，判断导致样品腐败的主要微生物及优势菌种。

1.5 抑菌效果

将10 g 样品分别添加适量3 种乳液拌匀真空分装后，以不加精油乳液的样品作为对照组，将4 组样品分别在25 ℃与4 ℃下贮藏，25 ℃下贮藏的样品在2、4、6、8、10、12 d 进行分析，4 ℃下贮藏的样品在3、6、9、12、15、18 d 进行分析。将不同时间的样品接种于优势腐败菌的选择性培养基上进行菌落总数检定，根据菌落生长情况，筛选出对优势腐败菌抑菌效果最好的精油乳液。

1.6 抑菌活性

（1）最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）的测定采用二倍稀释法[13]。以96孔无菌培养板为基础，在每个孔板中加入100 μL 相应菌株的液体培养基，第1 行加入100 μL 无菌水作为阴性对照，第12 行加入100 μL 菌培养液作为阳性对照；抑菌剂倍比稀释方法：在第2 行加入 3 种植物精油纳米乳液100 μL，吹吸3 次后，吸取100 μL 加入下一行中（初始精油纳米乳液浓度为50 mg·mL-1）。直到11 排，11 排吹吸混匀，取100 μL 弃用。最后，于2～12 行各加入菌悬液100 μL，在36 ℃下培养36～48 h。

（2）最小抑菌浓度的判断。如果菌液是透明的，则该浓度下精油纳米乳液显示出抑菌作用；如果菌液浑浊，有沉淀物或絮状悬浮物，或在液面以下或孔壁上形成一层菌膜，则该浓度下精油纳米乳液无抑菌作用。在此基础上，分别测定每种抑菌剂在培养板上对单株细菌的MIC 值。

1.7 乳液浓度优化

对筛选出的乳液设置0.2%、0.4%、0.6%、0.8% v/v和1.0% v/v 的精油浓度梯度，以原样品为对照组进行抑菌活性检定，筛选出合适的精油浓度。

1.8 植物精油纳米乳液表征

（1）粒径、PDI、Zeta电位测定。为了避免多次散射，用蒸馏水将乳液稀释100 倍。利用Zeta 电势分析仪测量溶液的颗粒大小、多分散度分布指数（Polydiseperse Index，PDI）、Zeta 电位。每个样品重复3 次取平均值。

（2）贮藏稳定性。取50 mL 各浓度梯度乳液于密封样品瓶中，在4 ℃和25 ℃下分别放置0、4、8、12、16 d，在每个测定点处测定粒径和Zeta 电位。

1.9 数据与分析

结果采用平均值表示，用Origin 2021 对数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 3 种植物精油纳米乳液的抑菌效果

《蒟蒻（魔芋）素食品》（Q/LHJS0001S—2019）规定，魔芋制品中菌落总数不应高于5 l g CFU·g-1。由图1 可知，室温组（25 ℃）各微生物的对数生长期主要在0～4 d，冷藏环境（4 ℃）下微生物对数生长期主要在0～9 d，在对数生长期，大肠杆菌与金黄色葡萄球菌都在迅速增长。在之后的贮藏期内，菌落总数趋于稳定，如室温组的金黄色葡萄球菌甚至出现菌落数回落的现象，说明第12 d，样品内的营养物质减少或有害废物积累到一定程度后使腐败菌不再生长，金黄色葡萄球菌的生长已经达到了峰值室温下对照组样品在第4 d 便已超过阈值，为5.5 l g CFU·g-1，肉桂、丁香、大蒜纳米精油乳液分别将魔芋制品中菌落总数超标的期限延长至12、10、8 d，说明3 种精油纳米乳液对样品的微生物生长均具有抑制效果，且肉桂精油的抑菌能力明显高于其他2 种精油，因此选用肉桂精油进行浓度优化实验。由4 ℃冷藏组的菌落生长情况可以看出，低温对腐败菌的生长有抑制效果，与植物精油纳米乳液对样品腐败菌的抑制具有协同作用。

图1 添加3 种精油纳米乳液的样品菌株浓度分析图

2.2 精油纳米乳液抑菌效果分析

根据各个培养基的菌落生长情况，发现孟加拉红培养基、CFC 培养基、不动杆菌培养基的各梯度菌落生长情况几乎为0，而PCA 培养基的菌落生长情况良好。根据菌落的颜色与形态判断导致样品腐败的主要微生物为金黄色葡萄球菌，另有极少量肠杆菌存在。MIC 测定结果验证了3 种精油纳米乳液对样品平板计数分离出来的2 种单菌株的抑菌能力大小，并具体显示了其产生抑菌效果的浓度范围。由表1 可知，肉桂精油纳米乳液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌较敏感，丁香精油纳米乳液对大肠杆菌较为敏感，大蒜精油纳米乳液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌敏感度较低。金黄色葡萄球菌的总体抑菌效果为肉桂精油>丁香精油>大蒜精油；大肠杆菌的总体抑菌效果为丁香精油=肉桂精油>大蒜精油，说明肉桂精油纳米乳液的抑菌效果较好。因此，选择肉桂精油纳米乳液进行表征和优化。

表1 3 种精油对2 种细菌的最小抑菌浓度表

2.3 肉桂精油纳米乳液浓度优化实验

设置肉桂精油体积浓度梯度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。由图2 可知，在室温条件下，肉桂精油纳米乳液的抑菌能力与精油浓度成正相关，且浓度为0.8%与1.0%时的菌落生长情况相近，说明在0.8%的肉桂精油浓度下纳米乳液的抑菌能力已接近饱和。

图2 不同浓度肉桂精油纳米乳液的抑菌能力图

2.4 植物精油纳米乳液表征

粒度、PDI、Zeta 电位是评价乳状液系统均匀度和稳定性的重要指标[14]。当PDI＜0.3，Zeta 电位≥30 mV 或≤-30 mV 时，该体系的稳定性良好[11]。由图3 可知，肉桂精油纳米乳液Zeta 电位的绝对值均＞30 mV；肉桂精油纳米乳液的粒径随着肉桂精油体积浓度的增大而增大；肉桂精油体积浓度为0.2%、0.4%、0.6%和0.8%时，PDI＜0.3，表明这4 个浓度梯度的肉桂精油纳米乳液体系较为稳定。

图3 各浓度梯度肉桂精油纳米乳液的Zeta 电位、粒径与PDI 图

肉桂精油纳米乳液在室温（25 ℃）和冷藏（4 ℃）条件下贮藏过程中的平均粒径以及Zeta 电位变化见图4、图5。2 种贮藏条件下肉桂精油的体积浓度为0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的乳液在贮藏过程中粒径变化较小；肉桂精油体积浓度为0.4%、0.6%、0.8%乳液的Zeta电位的绝对值在贮藏期高于30 mV。一般认为，Zeta 电位绝对值在25 mV 以上的乳液体系，具有足够的电斥力以避免乳液颗粒聚集[15-16]。同时，Zeta 电位值为负，表明液滴带有负电荷，在贮藏过程中可以提供静电斥力抑制乳液发生絮凝的现象。因此，添加肉桂精油0.4%、0.6%、0.8%的纳米乳液贮藏稳定性较好。

图4 肉桂精油纳米乳液贮藏过程中平均粒径变化图

图5 肉桂精油纳米乳液贮藏过程中Zeta 电位变化图

3 结论

本研究通过比较分析3 种植物精油纳米乳液对魔芋素毛肚的抑菌能力，筛选出最适精油。结果显示，①魔芋素毛肚的致腐微生物主要为金黄色葡萄球菌，同时存在少量大肠杆菌，换言之，金黄色葡萄球菌为魔芋制品中的优势腐败菌。②经过平板涂布计数与MIC 测定实验证明，肉桂精油对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的组合具有最好的抑菌效果。③对肉桂精油浓度梯度进行优化实验，通过抑菌能力实验、粒径、Zeta 电位、PDI 和贮藏稳定性等方法发现，0.8%体积浓度的肉桂精油纳米乳液的综合性能最强，抑菌效果最好。因此，本研究结果可以为魔芋制品的绿色保鲜研究提供参考。