液相色谱法在测定粮食作物中真菌类毒素的应用研究

◎ 梁 辉

（海南省粮油产品质量监督检验站，海南 海口 570203）

粮食安全关系国计民生，粮食作物的品质和安全是保障粮食安全的关键环节[1]。作为真菌类微生物的有害代谢产物，真菌类毒素是粮食作物中常见的一类有害物质，严重威胁着人类和动物健康[2]。因此，对粮食作物中真菌类毒素的准确测定显得尤为重要。

液相色谱法是一种基于液体为流动相的色谱技术，具有高分辨率、高灵敏度等优点。在毒素测定领域，液相色谱法已被广泛应用于多种毒素的分析，如真菌类毒素、有机磷农药、重金属等[3]。真菌类毒素是一类由真菌产生的有毒代谢产物。其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是粮食作物中最常见的3 种真菌毒素[4-5]。本研究利用液相色谱串联紫外和荧光检测器，对3 种真菌类毒素进行检测，旨在为粮食产品的检验检测提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1290 型高效液相色谱仪（配制荧光检测器和紫外检测器）；JOANLAB 轨道式振荡器；SHZ-D (Ⅲ)型循环水真空泵；MS204S 型电子天平；Milli Q 超纯水器；TG18G-Ⅱ型高速离心机；黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液购自国家标准物质平台；水为超纯水；乙腈购自默克股份两合公司。

1.2 样品来源

在市场上购买所需粮食样品。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的制备

称取50.0 g 粉碎后粮食样品于250 mL 磨口具塞三角瓶中，加入80% 乙腈100 mL，振荡提取30 min（300 r·min-1）；取滤液50 mL 置离心管中（5 000 r·min-1），离心5 min。取滤液10 mL，加水40 mL，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，备用。

取20.0 mL 上述提取滤液，以1.5～2 mL·min-1流速缓慢通过免疫亲和柱。以10 mL 水淋洗柱子2 次，弃去全部流出液，并使部分空气通过柱体。准确加入1.0 mL 乙腈洗脱，流速控制为1～2 mL·min-1，收集全部洗脱液于样品瓶中，氮气吹干。用20% 乙腈溶解混匀后，过0.22 μm 滤膜，待液相色谱测定。

1.3.2 标准溶液的配置

精密量取黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液适量，用色谱纯乙腈稀释制成含各标准品100 μg·mL-1的混合标准品溶液。

1.3.3 主要仪器参数

色谱条件：色谱柱选择Diamonsil C18，250 ×4.6 mm，5 μm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；VWD 检测器波长为220 nm；荧光检测器激发波长305 nm，发射波长460 nm；流动相：乙腈和0.1% 乙酸溶液。洗脱程序见表1。

表1 洗脱程序表

1.3.4 标准曲线的绘制

分别用刻度管移取0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.00 mL 混合标准品溶液于20 mL 的容量瓶中，分别用乙腈溶液定容，得到一系列不同浓度的标准溶液。浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg·mL-1的标准曲线系列溶液。分别精密量取各标准曲线系列溶液各20 μL，在拟定的液相色谱条件下进样分析，记录峰面积。以真菌毒素的浓度为横坐标，以其峰面积为纵坐标进行线性回归，获得标准曲线。

1.3.5 检测限与定量限

取混合标准品溶液拟定的色谱条件下进行分析，根据分析结果逐级稀释样品浓度，分别测定黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。

1.3.6 加标回收率测定

称取50.0 g 粉碎后粮食样品于250 mL 磨口具塞三角瓶中，分别加入混合标准品溶液。照“1.3.1”进行样品处理，并将制备好的样品进行液相色谱测定。

1.3.7 样品的重复性的测定

照“1.3.1”项下方法，处理样品并测定粮食样品中的黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、检测限和定量限的测定结果

黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定结果见表2。在拟定的色谱条件下，黄曲霉毒素B1在1.01～50.30 μg·mL-1范围内，线性方程为y=12 139x-2 703.2，R2=0.999 8；玉米赤霉烯酮在1.02～50.75 μg·mL-1范围内，线性方程为y=495.28x-85.947，R2=0.999 9；脱氧雪腐镰刀菌烯醇在1.02～51.15 μg·mL-1范围内，线性方程为y=26.292x+10.985，R2=0.998 4。

表2 标准曲线数据表

2.2 样品的加标回收率测定结果

黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的加标回收率结果见表3。结果显示，本方法测定各添加剂的加标回收率在97.02%～101.95% 范围内，测定结果的RSD 值均小于5%。因此，用本方法测定粮食样品中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇准确度良好。

表3 粮食样品的加标回收率测定结果表

2.3 样品的重复性测定结果

采用本方法，对“1.3.8”中加标回收率样品连续测定6 次，测定结果见表4。

表4 样品的重复性测定结果表

从表4的测定结果看出，对同一样品连续测定6次，黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定结果的RSD 分别为2.93%、2.41%和2.64%，均小于5%。因此，本方法测定样品的重复性良好。

3 结语

本研究建立了一种同时测定粮食作物中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的液相色谱方法。通过对定量分析方法的验证，得到以下结论：①所测定的3 种真菌毒素类化合物的线性关系良好，R2均大于0.990。②3 种真菌毒素中，检测限浓度最高为0.31 μg·mL-1，定量限浓度最高为0.93 μg·mL-1，表明该方法灵敏度较高。③本方法测定黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的加标回收率为97.02%～101.95%，测定结果的RSD 值均小于5%。④对同一样品连续测定6 次，黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定结果的RSD 分别为2.93%、2.41%和2.64%，均小于5%，表明该方法测定样品的重复性良好。综上所述，本研究结果能够为粮食产品提供更好的安全保障，对于粮食作物中真菌类毒素的检测和控制具有重要意义。