转基因抗虫棉研究进展

张安红 ， 肖娟丽 ， 赵战胜 ， 王志安 ， 刘圆 ， 罗晓丽

1.山西农业大学棉花研究所，山西 运城 044000；2.新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所，新疆 五家渠 831300

我国棉花的生产和消费在国民经济中占有举足轻重的地位。然而，棉花在整个生长发育阶段易受到多种害虫的危害。利用植物基因工程和遗传育种技术手段培育的转基因抗虫棉为控制棉铃虫的危害提供了新手段。转Bt基因抗虫棉花自种植以来，能有效地控制棉铃虫的种群数量，减少农药使用，在生产上取得了显著的经济、生态和社会效益。随着抗虫棉的广泛种植与田间农药用量的大幅度减少，棉田的生态系统也随之发生了很大的变化，棉铃虫的危害得到了有效防治。然而，种植过程中棉蚜、盲蝽蟓、烟粉虱等非靶标类害虫数量有大幅度增加的趋势，尤其是盲蝽类昆虫，对棉花的生产造成了巨大的经济损失［1-2］。

随着基因工程技术的快速发展，为了维持转基因抗虫棉的抗虫稳定性，延缓棉铃虫对抗虫棉的抗性，并对棉田次要害虫进行有效防治，广大转基因抗虫棉研究工作者做了大量的研究，转基因抗虫棉的研究得到了迅猛发展。目前，国内外已在防治棉盲蝽的转Bt基因棉花、营养杀虫蛋白Vip3棉花、RNAi转基因抗虫棉花以及通过基因编辑创制抗虫棉花等多个方面取得了进展。

1 转外源苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白系列抗虫棉

1981年，Schnepft和Whiteley首次克隆了编码Bt杀虫晶体蛋白的基因。截至目前，研究者已分离出40000多个Bt菌株，发现并登记的这类基因大约有190种，但已完成转基因抗虫棉的仅有cry1Ac、cry1F、cry2Ab及cry2Ae等。经过密码子优化的Bt基因已被成功地导入棉花，获得了一大批具有良好抗虫性的转基因棉花种质资源和品种，在生产上显示出良好的经济效益和社会效益［3］。

1.1 防治鳞翅目害虫棉花

目前，我国种植的转基因棉花主要表达cry1Ab/Ac基因。1992年，郭三堆等［4］利用分子设计技术人工合成了具有高杀虫活性的Bt杀虫基因GFM Cry1A。随后，在1994年与山西省农业科学院棉花研究所合作将该基因导入棉花，选育出晋棉26转基因抗虫棉品种，之后又选育出GK1、GK12、GK19、GKZ1国产单价转基因抗虫棉品种，并进行大面积推广应用，使中国成为继美国之后世界上第二个成功研制转基因抗虫棉的国家。为了提高抗虫棉的杀虫效率，延缓棉铃虫等害虫对杀虫蛋白产生抗性，郭三堆等［4］将具有不同杀虫机理的2个抗虫基因GFM Cry1A和Cpti同时导入棉花，创制了双价转基因棉花新种质。通过与国内多家育种单位合作，成功选育出sGK321（1998年）、中棉所41（2001年）和中棉所45（2003年）等双价转基因抗虫棉品种。刘志等［5］将Cry1A和雪花莲凝集素基因GNA导入棉花，选育获得转Cry1A+GNA双基因抗虫棉纯合株系TBG，其在苗期、蕾期、开花期和结铃期主茎叶都对棉铃虫幼虫具有很高的杀虫活性。吴家和等［6］将人工设计合成的Cry1Ac、Bt29K和慈菇蛋白酶抑制剂基因API-B导入棉花，培育出9个抗虫性好、农艺性状优良的转基因棉品系，对棉铃虫抗性均达到90%以上。张林水等［7］将Cry1Ac3和Cpti的融合基因与GNA共转入棉花中，获得了同时含有3个抗虫基因的转基因棉花新材料，该材料对棉铃虫具有较高的抗性。自1997年转基因棉花开始商业化种植以来，种植规模逐年快速增长，由当年的10万hm2增长到390万hm2，占棉花总种植面积的92%以上。其中，长江流域棉区和黄河流域棉区所种棉花几乎全部为转基因棉。到2002年，国产抗虫棉的种植面积达转基因棉总种植面积的52%，首次超过国外品种；到2005年，这一比率超过了73%。目前，国产抗虫棉品种已超过98%，在我国市场中占绝对主导地位［4］。

在开发新的Bt系列基因方面，湖南农业大学棉花研究所采用现代分子生物学技术与花粉管通道方法相结合，将来源于苏云金芽孢杆菌的另外一株革兰氏阳性菌株的Cry5b抗虫基因转入岱字棉品系晋1中，并育成了抗虫棉品系JX0010和JX0020。Cry5b抗虫基因与目前国内外推广应用的Bt抗虫基因Cry1a/1c不同。赵世浩［8］对Cry5b转基因品系进行了表达验证和生物安全性评价，鉴定结果表明JX0020对棉铃虫有较高的抗性，这为新型抗虫基因在棉花育种及品种推广上的应用提供了数据支撑。获得美国国家环境保护局［9］（Environmental Protection Agency，EPA）批准的拜耳作物科学研究所研发的转基因棉花品种Twinlink，含有2种蛋白毒素，分别是T304-40品系的苏云金芽孢杆菌Cry1Ab和GHB119品系的Cry2Ae，该品种可有效防治鳞翅目的棉铃虫、烟青虫、草地夜蛾等害虫。目前，转基因棉花品种Twinlink在澳大利亚、新西兰、巴西和加拿大等国家都获得了批准并进行商业化种植。此外，Bhupendra等［10］利用分子生物学技术从印度苏云金芽孢杆菌中分离并克隆了Cry52Co1基因，毒力试验结果表明其对棉铃虫幼虫的LC50为36.66 μg·mL-1，可作为新型抗虫蛋白基因用于转基因作物。以上研究为转基因抗虫棉花产业的持续稳步发展奠定了坚实的基础。

1.2 防治棉盲蝽棉花

Cry51A是一类特殊的Bt伴孢晶体毒素，其晶体结构与传统的Cty毒素不同，属于气单胞溶菌素型β穿孔蛋白。鞘翅类和半翅类昆虫具有特异性的毒蛋白，通过显微镜观察和免疫荧光染色法2种组织学手段阐明了植物血凝素对牧草盲蝽蟓的致死效应、靶组织和结合位点［11-12］。秦文强等［11］通过定点突变技术对已有原蛋白基因Cry51Aa1进行定向改造，将获得的突变体基因所表达的蛋白饲喂绿盲蝽并进行体外毒力试验，筛选出的新型突变蛋白基因Cry51Aa1.C006对绿盲蝽具有很强的毒杀效果。通过农杆菌介导方法将Cry51Aa1和Cry51Aa1.C006基因转入属于陆地棉品种的中棉所24中，转化体材料中Cry51Aa1.C006基因表达量在不同组织均高倍量表达。抗虫鉴定表明，11个转化体材料中有2个转化体对绿盲蝽的抗性表现最强。

为了挖掘潜在的外源抗虫基因，合成对刺吸式口器害虫有抗性的棉花转基因材料，李亚军等［12］选择Cry51Aa2.83416、Cry51Aa2.834CG、（E）-β Farnesene和Tma12这4个来源于苏云金芽孢杆菌的外源抗虫基因，通过构建抗绿盲蝽、蚜虫、烟粉虱4个基因的超表达载体，利用农杆菌转化法将它们分别导入棉花基因组中，并获得性状优良的转基因株系。绿盲蝽、烟粉虱取食经过改造的Cry51A转基因植株后，出现了不同比例的死亡，以此达到控制盲蝽蟓、烟粉虱的目的。2016年，Gowda等［13］通过定点突变技术对基因进行定向改造，获得了对西部牧草盲蝽和美国牧草盲蝽均具有一定杀虫活性的13种突变蛋白，其中Cry51Aa2.834-16蛋白的杀虫效果与Cry51Aa2蛋白相比增加了200多倍。通过棉花遗传转化获得了4个转化体材料，田间试验鉴定表明，GH-A767631转化体对西部牧草盲蝽抗性增加了30多倍，其余转化体抗性也显著提升，有效地减少了西部牧草盲蝽和美国牧草盲蜷的危害。以上研究为现阶段棉田减少农药使用，棉花次要害虫的防治以及棉花抗虫分子育种提供了一个新的途径和基础。

1.3 广谱抗虫棉花

Vip3是苏云金芽孢杆菌的另一种营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs），与Bt作用机制完全不同，Vip3是在苏云金芽孢杆菌营养生长对数期分泌的杀虫蛋白。Vip3蛋白具有广谱的杀虫效果，可毒杀小地老虎等对Bt蛋白非敏感害虫，在防治抗性害虫及扩大抗虫谱上可作为一种新的策略［14-19］。

Syngenta公司对转Vip基因抗虫棉进行了多年的田间抗虫试验，结果表明该抗虫棉能够较好地控制棉铃虫种群［19］。哥斯达黎加（2009）、韩国（2016）等国已先后获得转Vip3的棉花品种，并在田间进行了广泛的种植。张安红等［20］构建了植物表达载体pBin438-Vip3A，通过农杆菌介导法转化棉花品种‘冀合713’，将新型抗虫基因Vip3A转入棉花植株，室内抗虫性鉴定表明，与对照相比转基因植株对棉铃虫的抗性显著提高，并获得了2株高抗和3株抗棉铃虫的转Vip3A基因株系。Southern blotting结果显示，转基因株系BV01为单拷贝。ELISA检测表明，外源Vip3A基因在BV01的根、茎、叶、花、种子中都有表达。该研究创制出的新型抗虫转基因棉花材料，为培育棉花新型抗虫品种提供了种质资源。

2 RNAi转基因抗虫棉花

植物介导的RNAi抗虫新技术，可以有效、特异地干扰昆虫靶基因的表达，从而抑制害虫生长，该技术适用于包括咀嚼式和刺吸式在内的多种昆虫，为农业害虫的防治提供了特异性更强且环境安全的新思路。Luo等［21］经过大量的室内显微注射实验最终以影响中黑盲蝽卵巢发育的基因作为最佳靶标，利用农杆菌介导的遗传转化得到了高量表达靶标基因dsRNA的转基因棉花。连续2年的室外抗虫鉴定表明，该转基因棉花对中黑盲蝽表现出较强的抗性，降低了棉花被危害程度，实现了对中黑盲蝽的有效防控。中国科学院遗传与发育生物学研究所朱祯研究组与南京农业大学张天真实验室合作培育了可表达阻断棉铃虫激素合成dsRNA的转基因棉花，该转基因棉表现出很强的抗虫性，尤其对于Bt耐受性棉铃虫系有很好的防治效果［22］。分子检测结果表明，转基因棉花成功表达了高量dsRNA，受试昆虫体内靶基因表达明显下调，保幼激素本身合成被显著抑制。同时聚合上述RNAi和Bt的转基因棉花抗虫效果进一步增强。此外，分析多年抗虫生测数据表明，RNAi抗虫棉可明显延缓棉铃虫抗性的产生。例如，昆虫保幼激素RNAi抗虫棉及RNAi+Bt的聚合棉能够克服棉铃虫对单一策略转基因棉易产生耐受性的难题，同时为下一代抗虫作物的研发奠定了基础。罗晓丽等［23］利用棉蚜腺苷三磷酸酶E亚基基因构建RNA干扰载体，并通过农杆菌介导转化棉花，对获得的22个转基因阳性再生株的农艺性状和dsRNA表达量进行分析，并结合网棚和大田抗蚜鉴定结果筛选出4个转基因株系，其中CZ1、CZ2和CZ33个株系具有较高的抗蚜性，2015年和2016年蚜害减退率分别达70%和60%以上，为棉花抗蚜育种提供了新种质和新方法。梁思佳［24］利用植物介导的RNAi技术，以影响中黑盲蝽生殖能力的AsFAR基因为靶标，创制了能够高量表达AsFAR基因dsRNA的转基因棉花。研究结果表明，AsFAR转基因棉花可以成功抑制中黑盲蝽的生殖能力，导致其种群数量显著下降，有效减少中黑盲蝽在棉田的危害。岳臻［25］对调控取食的神经肽NPF、NPY基因进行了分子克隆和功能研究，并对转干扰载体NPF2-pCAMBIA3301的棉花进行Northern blot和Southern blot检测，发现转基因植株均能够表达NPF基因，同时棉铃虫取食转基因棉花后NPF表达量下降，取食量减少，生长减慢。王传鹏［26］利用RNAi技术对细胞色素P450基因CYP6CY19进行干扰，并观察干扰后蚜虫对棉花和黄瓜的适应性差异，结果显示棉花型棉蚜的RNAi干扰效率高于黄瓜型棉蚜，干扰CYP6CY19基因后，影响了棉蚜的产仔量和存活率，且对棉花型棉蚜的影响大于黄瓜型棉蚜，主要表现为产仔量减少和存活率降低，研究结果为探索棉蚜寄主专化型形成的分子机制提供了重要信息。

3 基因编辑创制抗虫棉花研发动态

基因编辑是一种能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术，给基因定向修饰提供了新的途径。CRISPR/Cas9基因编辑系统具有周期短、效率高、成本低等优势，在生物育种上潜力巨大［27］。

Lin等［28］利用棉铃虫抗性和易感种群间的全基因组关联分析、精细遗传作图和DNA序列比较等方法，发现在棉铃虫四跨膜蛋白基因HaTSPAN1中一个显性突变可以使棉铃虫对Cry1Ac蛋白产生抗性。利用CRISPR/Cas9技术敲除HaTSPAN1基因可以恢复棉铃虫抗性个体的敏感性，而插入突变却可以使易感个体产生125倍的抗性。金双侠等［29］利用构建sgRNA文库的方法对500多个棉花内源的抗虫相关基因进行饱和敲除，对获得的突变体库进行抗虫鉴定，发现有10%的突变体抗虫性发生了变化，通过对sgRNA的靶标位点信息进行分析，获得了这些突变的靶标基因的信息，直接合成了靶标信息明确且有抗虫功能的突变体材料。Muhammad［30］为了研究棉花与烟粉虱之间的分子互作，选择2个内源棉花抗虫基因GhMLP423和GhPR10，利用CRISPR/Cas9技术和超表达技术分别敲除和超表达这2个基因，研究结果表明，过表达GhMLP423和GhPR10的材料抗烟粉虱性能使基因编辑敲除的材料抗性降低，这2个基因在调控棉花抗烟粉虱调控网络中起着重要的作用。这些研究结果为棉花通过基因编辑进行抗虫育种研究开辟了一条新途径。目前，由于CRISPR/Cas9技术在棉花这类多倍体作物中普遍存在的脱靶问题在棉花抗虫研究中的应用和成功范例不多，主要集中于棉花棉铃虫易感基因的挖掘。未来研究中，随着对CRISPR/Cas9系统不断优化，相信CRISPR/Cas9基因编辑技术会在棉花优良性状改良和综合性状的提高方面带来新的突破［31］。

4 转次生代谢物基因与棉花抗虫性的相关研究

植物次生代谢物能抵御外界不良的环境影响，植物防御病虫害的主要次生代谢物有酚类、萜类、生物碱等，其中5-羟色胺是生物碱类色氨酸途径中产生的次生代谢物。孙佩瑶［32］研究发现棉花体内5-羟色胺的表达与其对绿盲蝽的抗性存在负相关，但与烟粉虱的抗性无关。胡琴［33］从棉花原生质体细胞壁重建的抑制消减杂交文库中克隆了1个能够促进细胞壁合成的基因GhLac1，并对其在介导棉花广谱抗性中的作用机制进行了研究，结果表明超量表达GhLac1能够促进木质素合成并增强棉花的广谱抗性，提高了转基因棉花对黄萎病菌、棉铃虫和棉蚜的抗性。张肖丽［34］对不同棉酚含量棉花品种的抗虫性进行了鉴定，结果显示棉酚可影响棉铃虫、甜菜夜蛾的生长发育，这与棉花防御酶、昆虫解毒酶及乙酰胆碱酯酶相关，且棉酚含量越高，棉花抗虫性越强。

5 展望

单价抗虫棉只对以棉铃虫为主的鳞翅目和鞘翅目害虫有抗杀作用，对棉蚜、红蜘蛛、棉盲蝽、烟飞虱等害虫没有作用或效果甚微。长期种植转基因抗虫棉，虽有效防治了棉铃虫的发生，但由于农药施用量大大减少，一些次要害虫，如盲蝽象、蚜虫等危害日益突出，逐渐上升成为棉花主要害虫；同时，抗虫棉本身也存在生长发育后期抗虫性下降、可能发生抗性棉铃虫等综合问题，所以需要加大力度寻找新型有效的抗虫基因资源。采用RNA干扰、基因编辑等新型生物技术手段研发转新型双基因、多基因的抗虫棉，有利于提高转基因抗虫棉的综合抗虫能力。

目前，发现并登记的cry1～cry67基因大约有190种，但获得转基因抗虫棉的Bt基因仅有几种，如cry1A、cry1Ab、cry1Ac、cry1F、cry2Ab及cry2Ae等。挖掘新的Bt基因，培育和现有Bt棉花不同作用机制的新抗虫棉花品种，或者研发针对同一害虫进行多种Bt毒素叠加的抗虫棉，对棉铃虫等靶标害虫的抗性治理具有十分重要的意义。此外，为了延缓抗性害虫的产生和延长转基因抗虫棉的使用年限，可以将不同杀虫机理的Bt基因同时导入棉株，利用不同基因的互补作用来增加抗虫范围和抗性水平。如Vip3与Cry蛋白具有不同的杀虫机制且它们的杀虫谱互补性很强，采取这2类基因叠加的策略来研发新型转基因抗虫棉花，有望得到更广谱的抗虫品种。