西藏山羊与柴达木山羊精液品质分析研究

李玉玲,马元梅,王 伟,李明亮,张博皓,张 楠,赵春川

(青海省畜禽资源遗传保护利用中心,青海 西宁 810016)

精液品质检查的主要的目的在于判定精液品质的优劣,同时为精液稀释冷冻保存提供依据。

种公羊精液品质的优劣能够直接影响到母羊的受胎率、羔羊的生产性能以及羊场的效益,影响种公羊精液品质的因素有很多,如营养、年龄、季节等,有关这方面的报道已有很多,但还没有对西藏山羊和柴达木山羊精液品质差异的研究。本文以青海省畜禽遗传资源保护利用中心科研基地饲养的西藏山羊和柴达木山羊的精液品质记录为资料,分析研究其差异,以最大限度地提高种公羊的利用率,为地方畜禽遗传资源保护提供依据。

1 材料与方法

1.1主要仪器设备、器械 电子天平、生物相差显微镜(日本OLYMPUS TL4)、显示屏、恒温加热板、精子密度仪(卡苏公司)、程控冷冻仪(法国卡苏公司)、细管冻精支架、梅香牌恒温水浴锅、恒温箱、冰箱、剪刀和卡苏公司0.25 mL的微型细管等。

1.2主要试剂 柠檬酸钠、蒸馏水、姬姆萨染液、磷酸二氢钠、甲醛、甲醇、甘油、双蒸馏水、卵黄、果糖等。

1.3试验动物与饲养管理 选择两个品种年龄相当的成年公羊各15只,共计30只进行试验。试验羊均来自青海省畜禽遗传资源保护利用中心科研基地饲养的西藏山羊和柴达木山羊,均为舍饲,健康且无疾病。

1.4采精方法 采精前清洁种公羊体表,清理杂毛,清洗包皮。每周采精2～3次,每次根据试验羊只的体质状况连续排精两回(间隔时间为15～20 min)。采用真台羊假阴道法采精,采精室用具用酒精进行清洁、消毒,将假阴道温度调节到36℃～39℃,对气压、润滑剂进行调试,直至正常。

1.5稀释液和冷冻液配制

Ⅰ稀释液:用电子天平准确称量蔗糖3.7 g、柠檬酸钠3.7 g、果糖0.5 g等,试剂先用双蒸水将其溶解,经过滤和消毒后为基础液备用。待冷却后(室温)将基础液的85 mL放于三角烧瓶中,加入卵黄15 mL,用磁力搅拌器充分搅拌均匀,之后每100 mL该溶液中加入5～10万IU的青链霉素。

Ⅱ冷冻液:取88 mL稀释液Ⅰ和12 mL甘油放于容器中,摇5 min使其充分混合。

1.6精液的稀释与平衡 精液采集后,将镜检合格的精液立即用Ⅰ液按稀释总量一半的比例进行等温稀释,待降温后将水浴状态下储精杯置于5℃的冰箱内平衡3 h。在经过第一次稀释平衡的精液中再加入含冷冻保护剂的等温Ⅱ液至稀释总量,然后放入5℃的冰箱内继续平衡1 h。

1.7细管冻精的制作 按《山羊精液冷冻保存技术操作规程》进行分装,水平排放在细管架上放入程控冷冻仪,冷冻7～8 min后投入液氮中。

1.8镜检及冻精保存 从制作好的细管冻精中随机抽取1～3支,在40℃～44℃温水中解冻13～15 s,然后在显微镜下观察解冻后的活力,活力检测在0.3以上便可收集保存,否则弃去不用。将制作好的细管冻精装入冻精袋,标注公羊的品种、冻精数量、精液活力以及生产日期等信息后便可装入液氮罐长期保存。

1.9精液品质检查

1.9.1鲜精品质检查 鲜精采集后,先用10 μL 移液抢取出5 μL于载玻片上,盖上盖玻片,放入38℃恒温相差显微镜下观察其活力,再用电子天平称重法计算出采精量,最后用法国卡苏公司密度仪测定精子密度。

1.9.2冻精品质检查 将同一批次的细管冻精置于38℃温度下,用同一时间水浴方法进行解冻,检查冻后活力。

1.9.3精子畸形率和精子顶体完整率检查 在400倍光学显微镜下检查精子畸形率,在1 000倍显微镜下观察精子顶体。对精子畸形率和精子顶体完整率进行检查时,每个抹片至少观察200以上精子(分左右两个区),取两片的均值。根据精子顶体的外形和损伤情况,将精子顶体分为4种类型,即:Ⅰ正常:顶体形态完好,有明显的顶脊,顶体部分呈均匀一致的紫色,核环部分呈规则的月牙形。Ⅱ顶体轻微膨胀:顶脊消失,顶体外援不规则;顶体部分的染色深浅不一。Ⅲ严重膨胀:顶体严重膨胀后,其边缘出现皱褶,有明显的条纹或者膨大呈冠状。Ⅳ顶体脱落:顶体部分脱落(顶体形成缺口并脱离或翻转)或顶体完全脱落。Ⅰ为正常完好精子,后三种均属顶体损坏精子。试验重复3批次以上。

精子畸形率(%)=畸形精子数/精子总数×100%

精子顶体完整率(%)=顶体完整精子数/总精子数×100%

1.10精液品质指标 精液量、精子密度、精子活力、精子畸形率以及精子顶体完整率。

1.11冷冻精液标准

冷冻精液符合GB20557-2006《山羊冷冻精液》中的要求,即每支细管冻精冻精剂量值≥0.18 mL;活力≥35%;直线前进运动精子数≥1.5×107个;精子畸形率≤20%;顶体完整率≥40%;细菌数≤800个。

1.12数据统计分析

数据结果用平均数±标准差(Mean±SE)表示,再用SPSS17.0统计软件对试验数据进行处理和分析,以P<0.05作为差异显著性判断的标准。

2 结果与分析

2.1西藏山羊和柴达木山羊的鲜精品质指标

由表1可知,西藏山羊精液量平均为1.17 mL,柴达木山羊精液量平均为1.65 mL,柴达木山羊精液量高于西藏山羊,二者差异不显著(P>0.05);西藏山羊平均精子活力为69%,柴达木山羊平均精子活力为70.33%,柴达木山羊精子活力高于西藏山羊,二者差异极显著(P<0.01);西藏山羊平均精子密度为2.763×1010个/mL,柴达木山羊平均精子密度为2.915×1010个/mL,柴达木山羊精子密度高于西藏山羊,二者差异不显著(P>0.05);西藏山羊平均精子畸形率为9.23%,柴达木山羊平均精子畸形为7.08%,柴达木山羊精子畸形率高于西藏山羊,二者差异不显著(P>0.05);西藏山羊平均精子顶体完整率为87.03%,柴达木山羊平均精子顶体完整率为91.47%,柴达木山羊精子顶体完整率高于西藏山羊,二者差异不显著(P>0.05)。精液颜色均为乳白色。

表1 西藏山羊和柴达木山羊的鲜精品质指标

2.2西藏山羊和柴达木山羊的冻精品质指标

由表2可知,西藏山羊平均精子活力为35.54%,柴达木山羊平均精子活力为37.18%,柴达木山羊冻精精子活力高于西藏山羊,二者差异显著(P<0.05);西藏山羊平均精子畸形率为13.65%,柴达木山羊平均精子畸形率为11.15%,柴达木山羊冻精精子畸形率高于西藏山羊,二者差异不显著(P>0.05);西藏山羊平均精子顶体完整率为82.73%,柴达木山羊平均精子顶体完整率为84.92%,柴达木山羊冻精精子顶体完整率高于西藏山羊,二者差异不显著(P>0.05)。

表2 西藏山羊和柴达木山羊冻精品质指标

3 结论与讨论

3.1影响种公羊精液品质不同的因素很多,如品种、个体大小、饲养管理水平、采精频率、日照和季节等。许多研究表明,在同样的饲养管理条件下,公羊的品种不同,其生产的精液品质也不同,有的甚至差异很大。同一品种内,不同个体之间精液品质也会存在很大的差异。本研究发现,在饲养条件相同、健康状况良好的情况下,西藏山羊精液品质次于柴达木山羊。初步判断可能是由于二者遗传基因不同所致,具体原因还需进一步研究。

3.2冻精解冻和精液冷冻同样重要。对冷冻保存的精液,只有用适宜的解冻方法,才能保证其复苏良好,要避免因操作不当而影响冻精质量的评定[3]。只有解冻后活力≥35%,才能保证精液有受胎能力。本试验中两个山羊品种的精子在解冻后的活力均高于35%,符合GB20557-2006《山羊冷冻精液》标准。制作冻精应严格按照操作规程进行,必须把控好冷冻精液的每一个环节,避免因发生不必要的试验误差而影响试验结果。精子畸形率直接影响体外受精和胚胎移植,接受精子畸形率较高的母羊妊娠几率较低。本试验中两个山羊品种精子畸形率均低于20%,符合GB20557-2006《山羊冷冻精液》标准。