狗脊多糖对膝骨关节炎大鼠Caspase-1/NLRP3信号通路的影响*

梁 冰 赫天兰 徐西林 赵 兵△

膝关节骨性关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是一种好发于中老人群的慢性进行性骨关节病,主要以膝关节关节软骨退行性病变和关节周围骨质增生为病理特征。现代医学对于KOA的治疗以延缓软骨退化、降低疼痛、提高其功能、重建受损软骨为主,但治疗后易于复发,毒副作用明显,因此需要更好的治疗方法。近年来随着中医药介入KOA的治疗,KOA的临床疗效得以显著提高,但其作用机制尚不明确。为进一步探明中药改善KOA的作用机制,

本实验选取治疗KOA的狗脊多糖作为研究对象,膝关节腔内注射木瓜蛋白酶建立膝骨关节炎大鼠模型建立膝关节骨性关节炎模型,用蛋白质印记法检测膝关节软骨组织半胱氨酸天冬氨酸蛋自酶1(Caspase-1)/Nod样受体蛋白3 (NLRP3)的蛋白表达。以期为狗脊多糖改善KOA提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物实验选择SPF级健康成年雄性SD大鼠60只[哈尔滨医科大学实验动物学部提供,许可证号:SCXK(黑)2019-001]体质量(200±20)g。实验操作遵照实验动物伦理保护标准,饲养箱设置温度 20～23 ℃,湿度控制在50%～60%,每日6 h光照模拟。适应性饲养1周后称重实验造模。

1.1.2 主要药品及试剂狗脊多糖提纯方法:称取中药饮片狗脊多糖100 g,粉碎后过200目筛检,取狗脊细粉50 g,石油醚冷萃脱酯除去杂质,水提法粗提狗脊多糖,按照料液比1∶10比例,每次在80 ℃温度提取3小时,分别进行3次提取,合并提取液在55 ℃进行减压浓缩,将浓缩液以3500 r/min离心10 min,加入氯仿-正丁醇混合溶液进行充分振摇,经离心分离去除蛋白杂质,90%乙醇分级沉淀,3500 r/min离心10 min收集沉淀,无水乙醇洗涤收集物,经低温干燥获得狗脊多糖。按照人-大鼠体表面积折算公式计算狗脊多糖给药剂量,按照120、60、30 mg/kg阶梯浓度给药。狗脊多糖浓度检测方法:苯酚-硫酸比色法检测狗脊多糖的含量。

1.1.3 实验试剂主要仪器木瓜蛋白酶(规格:25 g,型号:P3250,批号:Lot# O51M1847V,由美国Sigma公司生产)。丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-a酶连免疫吸附试剂盒,胱氨酸天冬氨酸蛋自酶1、Nod样受体蛋白3抗体(购自上海生物工程有限公司)。Fax-20100型酶标仪购自美国INStat公司;尼康SMZ745型光学显微镜购自上海普赫生物科技有限公司;ChemiDoc-MP全能型凝胶成像分析仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 造模方法大鼠实验前禁食水24 h,称重,采用10%的水合氯醛溶液按30 mg/kg剂量进腹腔注射麻醉。大鼠仰卧固定于处置板上,大鼠膝关节屈曲位,备皮充分暴露注射点位,以骸骨下极白色骸键外缘的膝眼为进针点,向髁间窝方向注射木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶注射剂量0.1 ml/kg),注射后碘伏常规消毒,棉签按压注射针孔15 s。实验于第1、3、6天进行注射给药,3次注射后完成造模。向空白组大鼠,右膝关节注射生理盐水。

造模试剂:木瓜蛋白酶(规格:25 g,型号:P3250,批号:Lot# O51M1847V,由美国Sigma公司生产)。试剂配制方法[1]:将木瓜蛋白酶生理盐水分别配成4%浓度,注射大鼠膝关节腔。

1.3 动物分组及给药方法将75只大鼠随机分为随机分为对照组、模型及狗脊多糖高、中、低剂量组,每组15只,成功复制动物模型后对照组、模型组给予2 ml生理盐水灌胃,狗脊多糖高、中、低剂量组给予120、60、30 mg/kg阶梯浓度给药(灌胃治疗前将狗脊多糖溶解于2 ml生理盐水中),每日1次连续灌胃治疗4周。

1.4 标本采集与数据检测方法末次给药24 h后,大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉处死,大鼠眼眶取血,检测血清中白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子a(TNF-α)。

大鼠膝关节软骨组织研磨液制备:大鼠行颈椎脱臼处死,置于处置台手术剪打开双侧膝关节,充分暴露膝关节,采用尖手术刀剥离胫骨侧软骨、内外侧股骨骼关节软骨。集中收集软骨,剪碎处理,组织大小约 1 mm3/单位体积,大鼠软骨组织经液氮冷却3 min,将软骨组织、研磨粒15 mm磨珠放入研磨罐内,放入已经在-80 ℃度冰箱预冷好的适配器中,加入变性液,β-巯基乙醇,组织研磨仪上以3000 r/min研磨10 min,得到匀浆状的大鼠软骨组织研磨液。移液器吸取大鼠软骨组织研磨液0.02 ml,以3%乙酸溶液0.40 ml稀释缓冲,标本生物学纤维镜下观察标本内白细胞计数。ELISA试剂盒检测大鼠膝关节软骨组织研磨液MDA、SOD含量,使用酶标仪读取吸光度值,依据标准曲线计算酶活性。

Caspase-1/NLRP3蛋白检测方法:大鼠膝关节软骨组织研磨液加入组织裂解液,充分裂解离心对上清液定量参照试剂盒说明书操作流程进行蛋白检测,每组检测取50 μg样本进行SDS-聚丙乙烯酰胺凝胶电泳实验,常规转模、脱脂牛奶封闭、一抗5 ℃孵育过夜(NLRP3按照1∶3000、Caspase-1按照1∶2000、比例稀释),孵育洗涤后加入辣根过氧化物酶2抗室温孵育 2 h,暗室显色试剂盒显色曝光,检测蛋白灰度值与β-actin灰值比较计算蛋白表达含量。

2 结果

表1模型组中大鼠组织研磨液白细胞数量明显高于对照组及各剂量治疗组,治疗组药物剂量增加组织研磨液随之降低,表明狗脊多糖对炎性关节组织具有显著抗炎作用;表2狗脊多糖高中低剂量组治疗结束后IL-6、TNF-α炎症因子表达与模型组比较显著降低,表明通过IL-6、TNF-α抑制炎症反应;表3数据表明狗脊多糖可降低软骨组织MDA含量,提高组织SOD含量,治疗效果随治疗剂量而递增;表4高中低剂量治疗组Caspase-1/NLRP3相对蛋白含量表达与模型组比较显著降低,表明狗脊多糖可抑制Caspase-1/NLRP3蛋白表达从而抑制炎症反应。

表1 各组大鼠膝关节组织研磨液白细胞数量比较

表2 各组大鼠血清中IL-6 TNF-α含量比较

表3 各组大鼠膝关节软骨组织MDA SOD含量比较 (只,

表4 各组大鼠膝关节软骨组织Caspase-1/NLRP3相对蛋白含量表达(灰度值)比较 (只,

3 讨论

中国人口逐渐老龄化,KOA成为骨科常见疾病。在随着年龄变化骨骼钙盐流失,膝关节软骨、软骨下骨质、滑膜、关节囊结构发生了巨大改变,伴随着老年人体质量的增加,膝关节已经不能支撑人体负荷,在运动后出现疼痛,严重影响老年人的生活质量。疾病发展过程中累及骨骼肌肉,最终形成关节畸形,发展初期伴有明显的膝关节疼痛,疼痛因个体的耐受能力因人而异,但均伴有一定程度的膝关节活动受限。中医治疗早期辨证以痹证为主,疾病发展后期以痿病为主。临床以关节部位的疼痛、关节僵硬等症状伴随始终,具有很高的致残率[2]。KOA发病过程中,关节内氧自由基含量的异常表达可通过介导氧化反应引起软骨细胞膜及胞内线粒体正常结构的破坏,影响细胞内能量生成,阻碍基质蛋白多糖与胶原的合成,并诱导骨关节细胞线粒体凋亡途径发生,最终引起细胞发生自溶[3,4]。

狗脊具有祛风湿、补肝肾、强腰膝的功效,临床中用于治疗风湿痹痛,腰膝酸软等骨关节疾病。 现代药理学研究表明,狗脊中的化学成分主要含有多糖、糖苷类化合物、挥发油淀粉、芳香族、甾体类、萜类、黄酮类等化合成分。狗脊的70%乙醇提取物对去卵巢诱导的高转换型骨质疏松大鼠体内的抗骨质疏松活性研究中证实,具有提高大鼠骨强度,阻止骨小梁微观结构恶化作用[5]。

临床中使用的狗脊多为产自中国华东、华南及西南地区的金毛狗脊,以干燥的根茎部位入药。味苦、甘,性温。骨关节炎发病过程中氧化反应的转归影响较大的因素主要有以MDA和NO为代表的促氧化因子和以SOD为主的抗氧化因子[6,7]。

Nod样受体蛋白3 (NLRP3)炎症小体能够调节半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 (Caspase-1)活化,诱导细胞炎症,是各种炎症性疾病治疗的靶点[8]。综上所述,狗脊多糖可降低膝关节骨细胞炎症因子表达,抑制氧化应激反应,缓解大鼠膝关节软骨组织损伤,减少关节腔内炎性渗出,其机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1信号通路相关,为临床上使用狗脊多糖治疗KOA提供了理论依据。

实验过程中发现大鼠在完成3次关节腔注射木瓜蛋白酶注射后,关节腔均出现不同程度关节滑膜组织损伤,膝关节组织研磨液白细胞计数升高,大鼠膝关节软骨组织中超氧化物歧化酶含量升高,丙二醛含量降低、大鼠血清中白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α含量升高,炎症因子明显升高符合滑膜炎表现。与模型组相比狗脊多糖低、中、高剂量组膝关节组织研磨液中超氧化物歧化酶含量呈升高趋势,大鼠血清中的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6含量、丙二醛含量呈下降趋势;与模型组比较狗脊多糖低、中、高剂量组膝关节软骨组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1/Nod样受体蛋白3表达呈下降趋势,结果表明狗脊多糖主要通过抑制大鼠膝关节软骨组织炎症反应和氧化应激反应,并通过抑制胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1/Nod样受体蛋白3表达治疗大鼠模型。